체외 혈액-뇌 장벽 모델을 통한 FITC와 FITC-페리틴의 투과 연구

초록

출처: Fiandra, L., et al. 쥐의 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 FITC 로딩 페리틴의 체외 투과: 나노 제형 분자의 전달을 연구하는 모델. J. Vis. 특급 (2016).

이 동영상은 유리 FITC 및 FITC 로딩 페리틴과 함께 막 삽입부의 성상세포와 내피 세포를 사용하여 시험관 내 혈액 뇌 장벽(BBB) 모델을 통한 투과를 연구하는 방법을 보여줍니다. FITC-페리틴은 내피 세포의 수용체에 결합하여 막 장벽을 넘어 하부 챔버로 이동한 반면, 자유 FITC는 제한된 투과를 보이며 상부 챔버에 머물렀습니다.

프로토콜

1. BBB 모델 설정

참고: 혈액뇌장벽(BBB) 모델을 확립하기 위해 상업적으로 이용 가능한 1차 쥐 뇌 미세혈관 내피 세포(RBMEC) 및 쥐 피질 성상세포(RCA)를 사용하는 것이 좋습니다. 모든 단계는 층류 후드에서 취급되는 멸균 시약과 일회용품으로 수행해야 합니다.

1. 세포 배양
   1. 세포 배양 플라스크를 폴리-L-라이신 100μg/ml(실온에서 1시간, RT) 또는 피브로넥틴 50μg/ml(37°C에서 1시간)로 코팅하여 각각 RCA 또는 RBMEC의 부착을 촉진합니다. 그런 다음 5% 소 태아 혈청, 1% 내피 세포 성장 보충제 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(sECM)을 보충한 내피 세포 배지에서 1 x 10⁶ RCA 및 5 x 10⁵ RBMEC를 해동합니다. 20ml sECM의 T175 플라스크에 RCA를 파종하고 10ml sECM의 T75 플라스크에 RBMEC를 파종합니다.
      참고: RCA 및 RBMEC의 해동 및 시딩 통로는 BBB 모델로 테스트할 실험 조건의 수에 따라 세포 밀도 및 배양 시간 측면에서 조정해야 합니다. 1 x 10⁶ RCA 바이알 1개와 5 x 10⁵ RBMEC 바이알 1개로 시작하여 최대 20개의 BBB 함유 인서트를 얻을 수 있습니다.
   2. RCA의 경우 약 80% 합류, RBMEC의 경우 90% 합류할 때까지 약 6일 동안 가습 분위기에서 37°C 및 5% CO₂로 셀을 유지합니다. 트립신-에틸렌디아민 테트라아세트산(트립신-EDTA) 용액(트립신 1:250)을 사용하여 5분(T75 플라스크의 경우 트립신 1ml, T175 플라스크의 경우 2ml)으로 세포를 분리합니다. sECM(2:1)으로 트립신 활성을 중지하고 750 × g에서 5분 동안 원심분리 세포 현탁액을 투여하고 60ml sECM에서 펠릿을 재현탁합니다.
   3. RBMEC를 3개의 T175 플라스크로 분할하고 삽입물에 파종하기 전에 sECM에서 3일 더 배양합니다. Burker 챔버의 광학 현미경으로 트리판 블루로 1:1로 희석된 세포 현탁액을 관찰하여 살아있는 RCA의 총 수를 계산합니다.
2. 삽입물에 Cell Seeding
   1. 6개의 멀티웰 투명 인서트로 구성된 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 멤브레인의 한쪽 면에는 폴리-L-라이신 100μg/mL로, 다른 면에는 피브로넥틴 50μg/mL를 처리하여 RCA 및 BMEC를 부착할 수 있도록 합니다. PET 멤브레인과의 접촉을 피하기 위해 핀셋으로 인서트를 다루십시오.
      1. 인서트를 6웰 플레이트에 놓고 피브로넥틴 용액(최소 500μl)을 상부 챔버에 추가합니다. 37°C에서 1시간 배양 후 피브로넥틴 용액을 제거하고 멀티웰 플레이트에서 인서트를 제거한 다음 이미 코팅된 인서트의 멸균 지지대로 사용되는 150cm²페트리 접시 바닥에 거꾸로 놓습니다.
      2. 800μl의 폴리-L-라이신을 인서트의 바닥면에 부드럽게 추가하고(그림 1A 참조, RCA 시딩이라고 함) RT에서 1시간 동안 인서트에 용액을 유지합니다.
      3. 용액을 흡입하고 인서트를 RT에서 15-30분 동안 건조시킵니다. 인서트는 이제 cell seeding을 할 준비가 되었지만 BBB 구조를 진행하기 전에 4°C에서 며칠 동안 multi-well plate에 보관할 수도 있습니다.
         참고: FD40 플럭스 측정에 의한 BBB 설정을 검증하기 위한 대조군으로 사용할 세포가 없는 코팅된 삽입물을 3개 이상 유지하는 것을 잊지 마십시오.
   2. 거꾸로 된 삽입물에 800μl의 세포 현탁액을 떨어뜨려 폴리-L-라이신 코팅 삽입물의 바닥면에 RCA(35,000/cm²)를 시딩합니다(그림 1A). 세포가 멤브레인에 효율적으로 부착될 수 있도록 RT에서 4시간 동안 인서트의 RCA 현탁액을 그대로 둡니다.
   3. 잔류 용액을 흡인하고, sECM 2ml가 들어 있는 웰에 삽입물을 넣고, 가습 분위기에서 멀티 웰 플레이트를 37°C 및 5% CO₂로 유지하면서 2일마다 sECM을 교체합니다.
   4. 3일 후 RCA가 인서트의 아래쪽 면을 코팅하면 다음 단계에 따라 RBMEC를 인서트의 위쪽에 시딩합니다.
      1. T175 플라스크에서 RBMEC를 분리하고 1.1.2 및 1.1.3 단계에서 보고된 대로 살아 있는 총 세포를 계산합니다.
      2. RBMECs(60,000/cm²)를 sECM(1,000 μl)의 인서트 상부 표면에 시딩하고(그림 1B), 성상세포가 있는 3개의 인서트는 TEER(TransEnhelial Electrical Resistance) 배경으로 사용합니다. 다중 웰 플레이트를 표준 배양 조건에 놓습니다. 시스템을 최소 3일 동안 배양으로 유지하고 2일마다 내부 및 하부 챔버의 sECM을 교체합니다.

2. BBB 검증

1. TEER 측정
   1. 공동 배양 3일째에 BBB 베어링 인서트를 4ml의 sECM으로 채워진 적절한 챔버(캡이 있고 챔버와 캡 모두에 한 쌍의 전압 감지 및 전류 전극이 포함되어 있음)에 삽입하여 TEER을 확인합니다. 상피 조직 전압계/저항계에 연결합니다.
   2. 셀 BBB 시스템의 TEER 측정과 함께 BBB로 얻은 값에서 뺄 RCA가 있는 3개 인서트의 TEER 값을 기록합니다. 결과 TEER 값에 인서트 표면(4.2cm²)을 곱하여 결과를 Ω x cm²로 표현합니다.
   3. 공동 배양 3일차부터 매일 TEER을 측정합니다. 메모: TEER이 증가하는 초기 기간 후에 기록된 값은 최소 연속 2일 동안(보통 공동 배양 5^{일과 7일 사이}) 안정적으로 유지되어야 합니다. 이 시점에서 BBB는 검증의 두 번째 단계(섹션 2.2) 및/또는 trans-BBB 실험을 수행할 준비가 됩니다.
      참고: 섹션 2.1에 설명된 절차는 다음 투과성 실험(섹션 3)에 전념하는 동일한 BBB 시스템에서 수행할 수 있습니다. 멸균 상태에서 작동하십시오.

3. FITC 로딩 페리틴의 Trans-BBB 투과(FnN)

참고: 인간 페리틴(Fn)의 재조합 변형으로, 대장균에서 생산되고 나노케이지(FnN)에서 조립됩니다. FnN에는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)가 적재되어 있으며 Fn과 적재된 분자의 농도가 정확하게 측정됩니다.

1. FITC 및 FITC-FnN의 Trans-BBB 플럭스
   1. 다음 단계에 따라 검증된 BBB 모델의 상부 챔버에서 하부 챔버(보통 공동 배양^5-7일째)에서 FITC-FnN 플럭스를 배양 7시간 및 24시간 후의 유리 염료와 비교하여 측정합니다.
      1. 각 제형에 대해 최소 6개의 BBB 시스템의 상부 챔버에 FITC-FnN(50μg/ml FnN, 1.1μM FITC) 또는 동일한 양의 유리 FITC를 추가하여 7시간 후에 최소 3개 인서트의 하단 챔버에서 2ml의 sECM 용액을 회수하고 24시간 후에 다른 3개 인서트의 하부 챔버에서 sECM 용액을 회수합니다.
      2. 수집된 샘플 중 500μl의 형광 강도를 분광형광계(λ_ex 488 nm, λ_em 515 nm, slit 5)로 측정합니다.
      3. 동일한 분석 파라미터를 사용하여 500μl의 배지를 측정하여 sECM 배경 형광을 얻습니다. 모든 FITC 또는 FITC-FnN 형광 값에서 sECM 배경 형광을 뺍니다.
      4. 얻어진 형광 값을 500μl sECM에 용해된 유리 또는 나노 제형 염료의 알려진 농도(즉, 6.87, 13.75, 27.5, 55nM)로 생성된 두 개의 서로 다른 보정 곡선과 비교하여 투과된 FITC 또는 FITC-FnN의 농도를 측정합니다.

결과

그림 1: 삽입물에 대한 세포 시딩. RCA(A) 및 RBMEC(B) 파스딩 절차를 멀티웰 플레이트 인서트의 반대쪽 두 면에 연결합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
쥐 뇌 미세 혈관 내피 세포	이노프로트	P10308	Sprague Dawley 쥐의 뇌 조직에서 분리, 1 통과에서 냉동 보존 및 냉동 배송
피질 성상세포(cortical astrocyte	이노프로트	P10202	2일 동안 쥐의 뇌 조직에서 분리하고, 1번 통로에서 냉동 보존하고 냉동 상태로 배송했습니다.
내피 세포 배지 키트	이노프로트	P60104	ECM(500ml) 및 태아 보빈 혈청(25ml), 내피 세포 성장 보충제(5ml) 및 페니실린/스트렙토마이신(5ml). 사용하기 전에 37°C의 수조에서 따뜻하게 하고 빛으로부터 보호하십시오
페놀 레드가 없는 트립신-EDTA	유로클론	ECM0920D	사용 전 37°C의 수조에서 따뜻하게 하십시오
플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란 40000	시그마	FD40S	빛으로부터 보호
Dulbecco의 인산염 완충액 식염수(Ca 및 Mg 제외	유로클론	ECB4004L
트리톤 X-100	시그마	T8787
소 혈청 알부민	시그마	A7906
염소 세럼	유로클론	ECS0200D
폴리-L-라이신 하이드로브로마이드	시그마	P1274	동일한 솔루션을 여러 번 사용할 수 있습니다.
소 혈장에서 추출한 피브로넥틴	시그마	F1141	동일한 솔루션을 여러 번 사용할 수 있습니다.
폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 인서트	송골매	F3090	투명 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 멤브레인; 표면적: 4.2cm2; 기공 크기 0.4μm/표면적
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T175 Primo TC 플라스크	유로클론	ET7181
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