쥐 뇌의 다양한 세포 내 구획에서 프로테아솜 활동 측정

초록

출처: McFadden, T., et al. 설치류 뇌에서 세포 내 유비퀴틴-프로테아솜 활동 정량화. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 형량 펩타이드 분석을 사용하여 공포에 질린 쥐의 뇌와 대조군의 뇌에서 측면 편도체의 다양한 세포 내 구획에서 프로테아솜 활성을 측정하는 방법을 보여줍니다. 프로테아좀은 형광 펩타이드 기질을 절단하여 형광 분자를 방출하며, 이 분자는 핵 및 시냅스 단백질 분획에서 프로테아솜 활성을 평가하기 위해 플레이트 리더를 사용하여 정량화됩니다. 핵 활동이 증가하면 유전자 발현의 변화가 일어나고, 시냅스 활동이 감소하면 장기 기억 유지에 필요한 단백질 안정화를 나타냅니다.

프로토콜

1. 프로테아솜 활성 분석

참고: 프로테아솜 활성은 20S 프로테아솜 활성 키트의 약간 수정된 버전을 사용하여 균질화된 뇌 조직에서 측정할 수 있습니다. 이 분석은 완전한 26S 프로테아솜 복합체의 활성을 직접 측정하지 않습니다. 오히려, 20S 코어의 활동을 측정하는데, 이는 전체 26S 프로테아솜 복합체와 대조적으로 코어 자체의 활동을 이해하기 위한 대리자 역할만 할 수 있음을 의미합니다. 이 분석의 성공은 반복적인 동결-해동 주기 및/또는 특히 이온 계면활성의 수치 증가로 인해 감소하며, 360/460(여기/방출) 필터 세트와 최대 37°C의 가열 기능을 갖춘 플레이트 리더를 사용해야 합니다.

1. 플레이트 리더 설정: 37°C로 예열하고 실행하는 동안 유지합니다.​
   1. 여기(excitation)를 360으로, 방출(emission )을 460으로 설정합니다. 사용된 96웰 플레이트가 깨끗하면 광학 위치를 하단으로 설정합니다. 어둡은/검은색 96웰 플레이트를 사용하는 경우 광학 위치를 상단으로 설정합니다.
   2. 구형 플레이트 리더 모델은 형....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
20S 프로테아솜 액티비티 키트	밀리포어 시그마	APT280	다른 공급 업체는 다른 버전을 제공합니다
ATP	어부	FERR1441	다양한 기타 공급 업체
BioTek Synergy H1 플레이트 리더	(주)바이오텍	VATECHH1MT3	다른 공급 업체는 다른 버전을 제공합니다
프로테아제 억제제	밀리포어 시그마	P8340	다양한 기타 공급 업체
디엠소	디엠소	D8418	다양한 기타 공급 업체

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