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1. 프로테아솜 활성 분석
참고: 프로테아솜 활성은 20S 프로테아솜 활성 키트의 약간 수정된 버전을 사용하여 균질화된 뇌 조직에서 측정할 수 있습니다. 이 분석은 완전한 26S 프로테아솜 복합체의 활성을 직접 측정하지 않습니다. 오히려, 20S 코어의 활동을 측정하는데, 이는 전체 26S 프로테아솜 복합체와 대조적으로 코어 자체의 활동을 이해하기 위한 대리자 역할만 할 수 있음을 의미합니다. 이 분석의 성공은 반복적인 동결-해동 주기 및/또는 특히 이온 계면활성의 수치 증가로 인해 감소하며, 360/460(여기/방출) 필터 세트와 최대 37°C의 가열 기능을 갖춘 플레이트 리더를 사용해야 합니다.
- 플레이트 리더 설정: 37°C로 예열하고 실행하는 동안 유지합니다.
- 여기(excitation)를 360으로, 방출(emission )을 460으로 설정합니다. 사용된 96웰 플레이트가 깨끗하면 광학 위치를 하단으로 설정합니다. 어둡은/검은색 96웰 플레이트를 사용하는 경우 광학 위치를 상단으로 설정합니다.
- 구형 플레이트 리더 모델은 형광 판독 옵션에서 Auto-Gain으로 설정합니다. 최신 모델은 이를 위해 사전 설정되어 있습니다. 2시간짜리 시간으로 운동 달리기를 프로그래밍하고 30분마다 스캔(판독)합니다.
- 키트에 제공된 10x 분석 버퍼를 13.5mL의 초순수로 재구성합니다. 100mM ATP 14μL를 1x 버퍼에 추가합니다. 이는 샘플의 프로테아솜 활성을 크게 향상시키고 분석 신뢰성을 향상시킵니다. 최종 20S 분석 버퍼는 필요할 때까지 얼음 또는 4°C에서 보관할 수 있으며 몇 개월 동안 안정적입니다.
- 키트에 제공된 AMC 표준을 100μL의 DMSO로 재구성합니다. 표준은 빛에 민감하므로 어두운 곳이나 저조도 조건에서 이 단계를 수행하십시오.
- 어두운 곳이나 저조도 조건에서 재구성된 표준을 사용하여 AMC의 표준 곡선을 작성할 수 있습니다.
- 별도의 0.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0.5 및 0 μM AMC 농도에 해당하는 AMC 표준물질의 16, 8, 6.4, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4 및 0 μL를 추가합니다.
- 이 튜브에 동일한 순서로 84, 92, 93.6, 96.8, 98.4, 99.2, 99.6 및 100 μL의 20S 분석 버퍼를 추가합니다. 이를 통해 일련의 높은 AMC 농도에서 낮은 AMC 농도가 생성되며, 이는 균질화된 샘플에서 플레이트 리더 보정 및 프로테아좀 활성 분석에 사용됩니다.
- 필요할 때까지 희석된 모든 표준물질을 어두운 얼음 위에 보관하십시오.
- 키트에 제공된 프로테아좀 기질(Suc-LLVY-AMC)을 65μL의 DMSO로 재구성합니다. 기판이 빛에 민감하므로 어두운 곳이나 저조도 조건에서 이 단계를 수행하십시오. 20S 분석 버퍼를 사용하여 새로운 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 프로테아좀 기질을 1:20 희석합니다. 희석된 기질을 필요할 때까지 어두운 곳에서 얼음 위에 보관하십시오.
메모: 예를 들어, 플레이트에 10개의 샘플과 1개의 블랭크가 있는 경우 웰당 10μL에서 22개의 웰(중복 포함)에 대해 충분한 희석 기판이 필요합니다. 이는 피펫팅 오류에 대해 220 μL 필요 + 30 μL에 해당하며, 12.5 μL의 기질과 237.5 μL의 20S 분석 버퍼가 필요합니다.
- 원하는 샘플(동결된 경우)을 해동하고 정규화된 양을 96웰 플레이트에 추가합니다. 각 샘플을 중복하여 실행합니다. 필요한 샘플의 양은 조직 준비에 따라 다릅니다. 일반적으로 10-20 μg은 모든 세포 내 분획에 충분합니다.
- 초순수로 샘플 웰 부피를 80μL로 가져옵니다. 추가되는 양은 추가된 샘플의 양에 따라 다릅니다. 예를 들어, 샘플 1이 4.5μL의 단백질이고 샘플 2가 8.7μL인 경우 필요한 물의 양은 각각 75.5μL 및 71.3μL가 됩니다. 두 개의 개별 웰에 80μL의 물만 추가합니다. 이것들은 Assay Blanks.
가 될 것입니다.
메모: 피펫팅 오류로 인한 단백질 부피의 변화를 제한하기 위해 단백질 농도를 가장 농도가 낮은 샘플로 정규화할 수 있습니다. 이를 통해 모든 조건에서 동일한 샘플 볼륨을 사용할 수 있습니다.
- Assay Blank를 포함한 각 웰에 10μL의 20S Assay buffer를 추가합니다. 웰 전체에서 일관된 분석 부피를 보장하기 위해 여기에서 리피터/자동 피펫을 사용하는 것이 좋습니다.
- 선택 사항: 이 단계에서 원하는 경우 시험관 내 조작을 도입합니다. 이를 위해서는 각 샘플에 차량을 포함하여 처리당 추가로 2개의 웰이 있어야 합니다. 그렇다면 5-10μL의 약물/관심 화합물을 2개의 샘플 웰에 추가하고 다른 2개의 웰에 동등한 부피의 제어/비히클을 추가합니다. 플레이트를 예열된 플레이트 리더 또는 37°C 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다.
- 불을 끄거나 어두운 방으로 들어갑니다. 희석된 AMC 표준물질 100μL를 모두 새 웰에 추가합니다. 각 표준에는 단일 우물이 있습니다.
- 어두운 곳에서는 10μL의 희석된 프로테아솜 기질을 시료 및 분석 블랭크가 포함된 웰에 추가하되 AMC 표준물질은 추가하지 않습니다. 웰 전체에서 일관된 분석 부피를 보장하기 위해 여기에서 리피터/자동 피펫을 사용하는 것이 좋습니다.
- 플레이트를 플레이트 리더에 놓고 키네틱 런을 시작합니다.
메모: 플레이트는 운동 실행 중에 지속적으로 교반할 필요가 없지만 원하는 경우 사용자가 선택할 수 있습니다.
- 키네틱 실행이 끝나면 원시 360/460 형광 값을 Microsoft Excel로 내보냅니다.
- 각 표준물질, 각 시료 및 5개 스캔 모두에 대한 Assay Blank에 대한 중복 웰의 평균을 구합니다. 원시 형광 값은 시료 스캔 전반에 걸쳐 증가해야 하지만 표준물질 및 Assay Blank에 대해서는 안정적으로 유지(또는 약간 감소)해야 합니다.
- 가장 높은 AMC 표준 웰 평균을 취하고 알려진 농도(20μM)로 나눕니다. 이 값을 분석에 사용된 시료 농도로 나누어 표준화된 AMC 값을 구합니다. 각 샘플 및 Assay Blank 평균에 대해 표준화된 AMC 값으로 나눕니다.
- 이 최종 값을 취하여 분석에 사용된 샘플 농도로 나누어 각 샘플과 Assay Blank에 대한 정규화된 값을 구합니다. 5개의 스캔 모두에 대해 이 작업을 수행합니다.
- 5개의 스캔 모두에 대해 정규화된 각 샘플 값에서 정규화된 Assay Blank 값을 뺍니다.