허혈성 마우스 뇌 조직에서 세포 현탁액 얻기

초록

출처: Pösel, C., et al. 허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석. J. Vis. 특급 (2016년)

이 동영상은 뇌졸중 연구에서 염증 반응을 연구하기 위해 허혈성 마우스 뇌 조직에서 뇌 세포와 침투한 면역 세포를 효소 분해로 분리한 다음 밀도 구배 원심분리로 세포 파편과 수초를 제거하는 절차를 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 시약의 준비

1. 분해 완충액(반구당 1ml): 칼슘(Ca)과 마그네슘(Mg)을 함유한 Hanks Balanced Salt Solution(HBSS)에서 열분해 농도가 낮은 Liverase(예: Libalase)와 같은 정제된 소화 효소의 표준화된 혼합물을 2U/ml 농도로 용해합니다.
2. DNAse로 완충액 세척: DNAse I을 10%의 태아 송아지 혈청(FCS)을 함유한 HBSS(Ca/Mg(칼슘/마그네슘) 무함유))에 666U/ml의 농도로 용해합니다.
3. DNAse가 없는 세척 버퍼: FCS가 10% 함유된 HBSS(Ca/Mg free).
4. 밀도 구배 매체(반구당 5ml): 밀도 구배 매체 9부와 1.5M 염화나트륨 1부분을 혼합하여 스톡 등장성 밀도 구배 배지(SIP; 100%)를 준비합니다. FCS 3%를 함유한 HBSS(Ca/Mg free)를 적당량 첨가하여 SIP를 25% 밀도로 희석합니다.

2. 대뇌 조직을 단세포 현탁액으로 해리

1. 깨끗한 면도날로 뇌간과 소뇌를 조심스럽게 제거합니다. 깨끗한 면도날을 사용하여 뇌의 반구를 절제하고 관상평면을 따라 각 반구를 대략 같은 크기의 세 조각으로 자릅니다.
2. 5ml 주사기의 플런저 끝을 사용하여 100μm 세포 여과기를 통해 각 반구의 조직을 다집니다. 얼음처럼 차가운 HBSS(+Ca/Mg)로 세포 여과기를 지속적으로 헹굽니다. 균질화된 샘플을 얼음에 보관하십시오.
3. 286 x g 및 4° C에서 5분 동안 원심분리기를 사용하고 상층액을 조심스럽게 버립니다. 펠렛을 1ml의 분해 완충액에 재현탁시키고 현탁액을 2ml 튜브로 옮깁니다. 37°C에서 1시간 동안 천천히 연속 회전하면서 현탁액을 배양합니다.
4. 70μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 체로 치고 DNAse가 함유된 세척 완충액 3ml와 DNAse가 없는 세척 완충액 15ml로 철저히 헹굽니다. 286 x g 및 18°C에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다. 메모: DNAse를 사용하면 세포 응집으로 이어져 세포 생존을 저해할 수 있는 세포 용해로 인한 DNA 점액을 제거할 수 있습니다.

3. 미엘린 및 세포 파편 제거를 위한 밀도 구배 원심

분리

1. 세포 펠릿을 25% 밀도 구배 배지 5ml에 재현탁시키고 현탁액을 15ml 튜브에 피펫팅합니다. 반복적이고 부드러운 피펫팅으로 완전히 혼합하여 기포 형성을 피하십시오. 메모: 밀도 구배 배지는 세포 응집을 방지하기 위해 RT에서 사용해야 합니다.
2. 521 x g 및 18°C에서 20분 동안 원심분리기 로터의 가장 낮은 가속 프로파일을 사용하고 로터가 브레이크 없이 정지할 수 있도록 합니다. 흔들지 않고 원심분리기에서 튜브를 부드럽게 제거합니다. 미엘린 코트와 상층액을 조심스럽게 흡인하면서 튜브 바닥의 세포 펠릿을 보존합니다. 메모: 미엘린 코트 전체를 제거해야 하며, 남은 털은 유세포 분석을 손상시킬 수 있습니다.
3. 펠릿을 DNAse가 없는 세척 버퍼 10ml에 재현탁시키고 현탁액을 새 15ml 튜브에 피펫팅합니다. 메모: 이 세척 단계는 밀도 구배 매체의 충분한 제거가 최종 세포 샘플의 양과 품질에 크게 기여하기 때문에 매우 중요합니다.
4. 286 x g 및 10°C에서 5분 동안 다시 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다. 100μl의 냉세척 완충액에 세포를 재현탁시키고 혈구계에서 트리판 블루 배제를 통해 세포 수와 생존율을 측정합니다. 시료를 4°C에서 보관하고 신속하게 추가로 처리하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
MACSmix 튜브 로테이터	밀테니 바이오텍 GmbH
헤레우스 멀티퓨지 3SR+	써모 사이언티픽(Thermo Scientific
행크의 완충염 용액(HBSS)	Gibco/Life Technologies GmbH	14175-129
칼슘/마그네슘을 함유한 HBSS	Gibco/Life Technologies GmbH	제24020-091
리바아제 TL	로슈 진단 GmbH	5401020001	실온에서 사용
Percoll 플러스	GE 헬스케어 유럽 GmbH	Tel.: 17-5445-01
소 태아 세럼	PAN 생명공학	3302-P101003
트리판 블루	Gibco/Life Technologies GmbH	제15250-061
트루카운트	BD 바이오사이언스	340334
인산염 완충 식염수	바이오크롬 AG	패 182-10
DNase I	로슈 진단 GmbH	11284932001
실리콘 튜브, 1m	세계적인 정밀 기기	503022
파인 아이리스 가위 날카롭고 뭉툭한	정밀 과학 도구	14028-10
직선 1x2 치아 겸자	정밀 과학 도구	11021-14
무딘 끝 집게	정밀 과학 도구	11008-13
5ml 주사기 플런저	Carl Roth GmbH (브라운)	제96.1
셀 스트레이너, 100μm	I. 슈베르트 박사, BD	2360-00
Omnican 미세 복용량 주사기 1ML	브라운	미정
셀 스트레이너, 70μm	그라이너 바이오 원 GmbH	542 070
혈청학적 피펫, 10ml	그라이너 바이오 원 GmbH	607180
혈청학적 피펫, 10ml	사르스테트 AG&Co	86,12,54,025
혈청학적 피펫, 25ml	그라이너 바이오 원 GmbH	760180
혈청학적 피펫, 5ml	그라이너 바이오 원 GmbH	606180
혈청학 피펫, 25ml	사르스테트 AG&Co	86,16,85,020
혈청학 피펫, 5ml	사르스테트 AG&Co	86,12,53,025
팁, 0,1-10μl	코닝 B.V.Life 과학	4840
팁, 100-1000μl	그라이너 바이오 원 GmbH	740290
팁, 10-200μl	그라이너 바이오 원 GmbH	739296
반응 튜브 1,5ml	그라이너 바이오 원 GmbH	616201
반응 튜브 2ml	그라이너 바이오 원 GmbH	623201
세균 페트리 접시, 94x16mm	그라이너 바이오 원 GmbH	633180
팔콘 15ml	그라이너 바이오 원 GmbH	188271
팔콘 50ml	VWR 인터내셔널 GmbH (BD)	Tel.: 734-0448
Neubauer 혈구계	바이오크롬 AG	PDHC-N01
면도날	칼 로스 GmbH	CK07.1