파킨슨병의 쥐 모델에서 레보도파에 의한 운동이상증의 유도

초록

출처: Caulfield, M. E., et al. 파킨슨병의 쥐 모델에서 레보도파 유발 운동이상증의 유도 및 평가. J. Vis. 특급. (2021).

이 비디오는 도파민 전환 억제제와 함께 레보도파를 투여하여 파킨슨병 쥐 모델에서 레보도파에 의한 운동이상증을 유발하는 과정을 보여줍니다. 반복적인 주사는 뇌 뉴런을 과도하게 자극하여 운동 기능 장애를 일으킵니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 시약 및 소모품 준비

1. L-3,4-디하이드록시페닐알라닌 메틸 에스테르 염산염(레보도파 또는 L-DOPA) 및 벤세라지드 염산염, 말초 탈카르복실라제 억제제(재료 표 참조) 용량, 평가 빈도 및 조사 질문에 적합한 실험 일정을 결정합니다(그림 1).
   메모: 특정 치료법이 기존 L-DOPA 유발 운동이상증(LID)을 감소시킬 수 있는지 여부를 묻는 것부터 LID 유도를 예방하는 것에 이르기까지 다양한 답변을 구하기 위해 조사 질문을 제기할 수 있습니다. 그들은 또한 치료 효능이 레보도파의 용량에 의존하는지 또는 LID 발현 및/또는 치료 효능이 피험자의 성별, 종 및 연령에 따라 다른지 여부를 조사할 수 있습니다.
2. 연구 기간 동안 진행 중인 체중 변화를 기반으로 적절한 약물 양을 계산하기 위해 매주 쥐의 체중을 측정합니다.
   메모: LID+ 쥐의 활성 증가로 인해 장기적인 L-DOPA 치료로 체중 감량의 가능성이 있습니다. 체중 감소가 발생하면 L-DOPA 주사 후 쥐에게 영양학적으로 완전하고 매우 맛있는 간식(재료 표 참조)을 제공하십시오.
3. 각 주간 농도에 필요한 L-DOPA 및 벤세라지드의 양을 계산하고, 주입일마다 동결건조된 분취액의 무게를 측정하고 -20°C에서 유리 호박색 바이알에 1-2주 동안 함께 보관합니다.
   메모: 목표 용량은 12mg/kg 또는 12mg L-DOPA/체중 1000g입니다. 추가 정보(Supplementary Information)는 쥐 체중 1cc/kg의 주사량에서 체중 12mg, L-DOPA/체중을 사용하여 일주일 중 매일 필요한 L-DOPA 및 식염수의 양을 결정하기 위한 계산의 예를 제공합니다.

2. 룸 및 케이지 설정

1. 6-하이드록시도파민(6-OHDA) 병변 수술 후 3-4주 후 L-DOPA 치료 첫날에 IACUC 승인 농축을 포함하여 쥐를 단일 주택으로 옮깁니다.
2. 행동 평가에 대한 또래의 간섭을 피하기 위해 연구 기간 동안 단일 주택을 유지하십시오.
3. LID 등급이 지정된 날에는 쥐를 최적으로 볼 수 있도록 약 45° 각도로 회전하여 가정용 케이지를 강철 와이어 랙에 놓습니다(그림 2A). 식별 태그(그림 2B)를 위로 뒤집고 케이지 내의 물병, 음식 선반 및 모든 유형의 농축물(그림 2C)을 제거하여 행동 평가에 대한 방해를 방지합니다.

3. 레보도파 주사 및 운동 이상증 등급

1. L-DOPA의 피하 주사
   1. L-DOPA를 매일 주입하기 직전에 호박색 바이알에 미리 계량된 동결건조된 L-DOPA 및 벤세라지드 혼합물에 적절한 양의 멸균 식염수를 넣고 10초 동안 잘 흔듭니다(1.3단계).
      참고: 목표 주입량은 체중 1mL/1000g(mL당 12mg L-DOPA 포함)입니다. 멸균 식염수의 부피는 연구당 동물의 수에 따라 달라집니다.
   2. 개별 주사기(예: 1.0 또는 0.5mL, 26G 바늘)에 각 동물에 필요한 부피(1mL/kg 쥐 체중)를 채우고 각 주사기에 개별 동물 식별 라벨을 붙입니다.
      메모: 주입할 때까지 채워진 주사기를 멸균 파우치에 넣어 빛으로부터 보호하십시오. L-DOPA는 수성 환경에서 산소와 빛이 있는 곳에서 빠르게 산화됩니다.
   3. 첫 번째 케이지를 주입 벤치로 가져옵니다.
   4. 쥐를 케이지에서 꺼내 주입 표면에 놓습니다.
   5. 주로 사용하지 않는 손바닥으로 쥐가 놓여 있는 표면에 머리와 어깨를 부드럽게 제지합니다.
   6. 주로 사용하지 않는 손의 엄지와 검지로 견갑골 위에 있는 등 피부의 피부를 부드럽게 문지릅니다. 그런 다음 주로 사용하는 손으로 L-DOPA 볼륨을 손가락 사이/아래 피하 공간에 주입하고 바늘을 가능한 한 몸과 평행하게 유지하여 근육 주사를 피합니다.
      메모: 쥐는 주입의 앞에 마취되지 않습니다.
   7. 사용한 각 개별 주사기는 날카로운 용기에 폐기하십시오.
   8. 쥐를 개별 우리에 다시 넣고 LID 평가일을 제외하고 영양학적으로 완전한 간식을 추가하여 평가가 완료될 때까지 행동 평가에 대한 방해를 피하십시오.
   9. 원하는 평가 시간과 평가 날짜에 연구에 참여한 쥐의 수에 따라 타이머를 1-2분으로 설정합니다. 다음 케이지를 회수하고 타이머가 지시할 때 다음 랫을 주입합니다.
   10. 모든 쥐가 주입될 때까지 1-2분마다 한 마리의 쥐를 주입하면서 이것을 반복합니다.
2. 레보도파에 의한 운동이상증 등급 주사 후
   1. 디스토닉 및 과잉운동성 운동이상증 운동증의 강도(표 1)와 빈도(표 2)를 원하는 시점으로 평가하며, 여기에는 LID 행동의 초기 시작, 최고 행동 및 감소 단계가 포함되어야 합니다.
   2. 수컷 및 암컷 성인 Sprague Dawley 또는 Fisher 344 쥐와 N = 40 쥐의 표본 크기의 경우, 첫 번째 L-DOPA 주입 후 20분 후에 운동이상증 평가를 시작하고, 쥐의 90%–100%에서 LID 행동이 중단된 시기에 따라 주입 후 220분 또는 270분까지 50분 간격으로 운동이상증 등급을 시작합니다.
   3. 1분 평가 간격을 사용하는 경우 타이머를 1분으로 설정하고 첫 번째 랫을 1분 동안 평가합니다. 다음 쥐로 이동하여 1분 동안 평가합니다. 모든 쥐를 통해 1분 간격으로 평가합니다.
   4. 타이머를 케이지 옆에 눈에 띄게 배치하여 LID 동작 강도(표 1)를 관찰하는 동시에 평가 기간 동안 주어진 동작(표 2)의 빈도를 추정할 수 있도록 합니다.
   5. 첫 번째 시점에 대한 평가가 완료된 후 다음 시점(예: 주입 후 70분)에 첫 번째 랫으로 다시 시작하고 모든 시점이 완료될 때까지 원하는 간격(예: 50분마다)으로 계속합니다.
      메모: L-DOPA 주입 및 LID 평가 작업이 중복되기 때문에 평가 날짜에 한 명은 주사, 다른 한 명은 행동 평가가 필요합니다.

결과

그림 1: 치료 일정의 예. 총 12주의 L-DOPA 용량 증량 타임라인의 예, 6-OHDA 병변 후 3주, 실험적 치료 후 4주부터 8주간의 L-DOPA 주사. 이 예에서 L-DOPA는 매일 거의 같은 시간에 주당 5회(월요일-금요일) 피하 주사되며, 2주 동안 처방된 각 L-DOPA 용량(3, 6, 9 및 12mg/kg)으로 투여됩니다. 행동 LID 평가는 각 L-DOPA 투여 수준의 1일, 6일, 10일에 이루어집니다.

그림 2: 대규모 쥐 실험의 LID 등급을 위해 설정...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100분 디지털 타이머	스테이플	1111764
Compass CX 컴팩트 스케일	오하우스	30428202
5-(2-아미노에틸)-1,2,4-벤젠트리올, 모노하이드로브로마이드	케이맨 화학 물질	25330	6-OHDA는 설치류에서 도파민성 병변 및 파킨슨병 증상을 유발하는 데 사용되는 카테콜아민성 신경독소입니다.
앨런타운 케이지	앨런타운, LLC	랫900	앨런타운 케이지는 모든 방향에서 쥐를 볼 수 있는 기능을 제공합니다.
영구적으로 부착된 바늘이 있는 BD 알레르기 전문의 트레이	BD (영어)	BD 305540 (영어	피하 L-DOPA 주사용
벤세라지드 염산염	시그마-알드리치	B7283	Benserazide는 PD의 설치류 모델에서 운동 이상증을 유도하기 위해 L-DOPA와 함께 사용되는 말초 탈카르복실라제 억제제입니다.
유리 호박색 섬광 바이알	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	B7921	멸균 식염수와 혼합될 때까지 -20°C에서 L-DOPA/benserazide를 보관하는 데 사용됩니다.
L-3,4-디하이드록시페닐알라닌 메틸 에스테르 염산염	시그마-알드리치	D1507	L-3,4-Dihydroxyphenylalanine 메틸 에스테르는 설치류의 파킨슨병 증상을 치료하기 위해 혈액 뇌 barrierand를 교차하는 L-DOPA의 전구체입니다.
페이퍼 메이트 샤프라이터 샤프펜슬	스테이플	107250
설치류는 영양학적으로 완벽한 농축 간식을 제공합니다.	바이오 서브	F05478
뚜껑이 있는 원형 얼음 양동이, 2.5 L	코 닝	432129
표준 플라스틱 클립 보드	스테이플	1227770
강철은 6' 긴 움직일 수 있는 선반을 타전했습니다	율린	H9488	너비/높이는 실험당 쥐의 필요/수에 맞게 조정할 수 있습니다.
멸균 식염수 0.9%	코비디엔/아가일	1020	L-DOPA/bens와 혼합하기 위해

년 ) ) 년 년