피질 오가노이드 절편(cortical organoid section)에서 신경 세포 노화 감지(Detection of neuronal aging in a cortical organoid section)

초록

출처: Shaker, M. R., et al. Robust and highly reproducible generation of cortical brain organoids for modelling Brain Neuronal Senescence In vitro. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 노화 세포에서 증가하는 베타-갈락토시다아제 활성을 염색하여 피질 오가노이드 절편에서 노화 뉴런을 감지하는 방법을 보여줍니다. 이 효소는 기질을 절단하여 파란색 산물을 생성하고, 이어서 염색된 뉴런을 현미경으로 관찰합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 피질 오가노이드의 신경 노화 특성화

1. 냉동 절편을 위한 피질 오가노이드 처리:
   메모: 이 단계는 Class 2 생물 안전 후드에서 수행되었습니다.
   1. 각각 1.5mL의 4% 파라포름알데히드(PFA)로 채워진 2mL 튜브를 준비합니다.
   2. P1000 피펫 팁의 끝을 자르고(넓은 구멍으로 만들기 위해) 각 오가노이드를 위에서 준비한 2mL 튜브 중 하나(튜브당 오가노이드 1개)로 부드럽게 옮깁니다.
      메모: PFA와 과도하게 분화 매체(DM) 매체가 혼합되는 것을 방지하기 위해 오가노이드를 P1000 파이펫 팁의 입구 쪽으로 가라앉히고 오가노이드를 파이펫팅하기 전에 팁을 튜브의 PFA 상단 바로 위에 놓습니다. 이를 통해 연구자는 오가노이드와 매우 적은 배지만 전달할 수 있습니다.
   3. 고정 과정이 4°C에서 1시간 동안 진행되도록 합니다.
   4. 자르지 않은 P1000 피펫 팁을 사용하여 과도한 PFA를 조심스럽게 흡입하고 1.5mL의 차가운 1x PBS(인산염 완충 식염수)를 추가합니다.
   5. 튜브를 실온(RT)에서 10분 동안 70rpm으로 설정된 오비탈 셰이커로 옮깁니다.
   6. 모든 PFA가 완전히 제거되었는지 확인하기 위해 차가운 1x PBS로 세척 과정을 세 번 반복합니다.
      메모: PFA를 일반 쓰레기통에 버리지 마십시오. 대신, PFA가 위험하므로 이를 위해 특정 화학 폐기물 처리 용기를 준비하십시오.
   7. 30% 자당을 함유한 1x PBS에 오가노이드를 담그고 모든 오가노이드가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 4°C에서 배양합니다.
      메모: 오가노이드가 가라앉는 데 필요한 시간은 크기와 나이에 따라 다릅니다. 생후 3개월 된 오가노이드는 최대 5시간이 소요될 수 있습니다.
   8. 절단된 넓은 구경의 P1000 피펫 팁을 사용하여 3-5개의 오가노이드를 30% 자당과 100% 최적 절단 온도(OCT) 매체로 만든 장착 용액이 들어 있는 장착 금형에 3:2의 비율로 부드럽게 옮깁니다.
   9. 실체현미경의 도움으로 10μL 피펫 팁을 사용하여 오가노이드를 격자 모양의 패턴으로 배치하고 배치합니다.
   10. 크라이오스 OCT 용액을 응고시키기 위해 드라이아이스에 주형을 놓고 저온 유지 장치를 사용하여 극저온 절편(16-20 μm)을 진행하기 전에
       메모: 노화와 관련된 베타-갈락토시다아제의 경우, 모든 조직이 가라앉은 후 절단을 위해 처리해야 합니다. 면역형광의 경우, 다음날 절편을 위해 조직을 처리할 수 있습니다. 즉시 염색하지 않는 경우, 절편을 포함하는 모든 슬라이드는 후속 면역형광 또는 베타-갈락토시다아제 전에 -20°C에서 보관해야 합니다.
2. 피질 뇌 오가노이드의 노화 분석 프로세스:
   메모: 다음 단계는 일반 실험실 벤치에서 수행할 수 있습니다.
   1. 뚜껑이 있는 현미경 슬라이드 염색 용기에 슬라이드를 옮기고 절편화된 오가노이드 조직을 1x PBS로 10분 동안 3회 세척하여 과도한 장착 용액을 제거합니다.
   2. 그런 다음 세척된 조직을 37°C에서 하룻밤 동안 갓 만든 베타-갈락토시다아제 염색 용액으로 배양합니다.
      메모: 베타 - 갈락토시다제 염색 용액은 인산염 완충액 (인산염 완충액 10mL : 1M NaH₂PO₄ 8.15 mL, 1M Na₂HPO₄ 1.85 mL) 조정 pH = 6, 100 mM의 헥사시아노페레이트 칼륨 (III), 100 mM의 헥사시아노페레이트 (II) 삼수화물, 5 M의 NaCl, 1 M의 MgCl₂ , X-Gal 20mg/mL CO₂ 는 beta-galactosidase 염색 용액의 pH를 변화시키므로 CO₂ 를 함유 한 표준 세포 배양 인큐베이터를 사용하지 마십시오.
   3. 베타-갈락토시다아제 용액을 제거하려면, RT에서 10분씩 3회 1x PBS로 염색된 조직을 세척합니다.
   4. 세척된 조직을 유리 퇴색 방지 장착제로 장착하고 장착 용액이 실온에서 30분 동안 응고되도록 한 후 현미경으로 봅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
16% 포름알데히드(W/V) 메탄올 무함유	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	28908	PFA의 4%는 1x PBS에 희석됩니다.
SC50 카메라가 장착된 CKX53 현미경	올림푸스
Dulbecco의 인산염 완충 식염수	시그마 알드리치 Pty Ltd	D1408-500ML
Neurobasal 배지	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	21103049	DM 미디어에 사용
OCT 임베딩 컴파운드 사쿠라 클리어 (118mL/병)	티슈 텍	4583
칼륨 헥사시아노페레이트 (II) 트리하이드레이트	시그마 알드리치 Pty Ltd	CP1087 (영문
칼륨 헥사시아노페레이트(III)	시그마 알드리치 Pty Ltd	455946
Prolong Glass Antifade Mountant	라이프 테크놀로지스 오스트레일리아(TFS)	P36980
자당	시그마 알드리치 Pty Ltd	PHR1001-1지	자당의 30%는 1x PBS에 희석됩니다.

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