방법 논문

마우스 모델에서 취급 유도 발작

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Batot, G., et al. Theiler의 쥐 뇌척수염 바이러스를 사용한 감염성 병인의 간질 모델. , J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus(TMEV)에 감염된 쥐에서 취급 유발 발작의 유도를 보여줍니다. 과흥분성 뉴런을 가진 감염된 쥐는 외부의 물리적 자극에 노출됩니다. 이러한 노출은 스트레스를 유발하여 뉴런의 비정상적인 전기 활동을 유발하여 발작을 일으킵니다.

프로토콜

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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 바이러스 접종

  1. 주사기의 살균
    1. 인슐린 주사기의 캡을 제거합니다. 2.5mm의 적절한 주입 깊이를 보장하기 위해 바늘 주위에 폴리에틸렌 튜브를 고리로 추가합니다. 주사기를 에탄올에 30분 동안 담급니다. 주사기를 자외선 아래에 30분 동안 놓습니다.
    2. 캡을 바늘에 다시 끼웁니다. 주사기를 살균 파우치에 싸서 테이프로 밀봉합니다. 준비 날짜가 표시된 라벨.
  2. 바이러스 주입
    1. -80 °C 냉동고에서 Daniel의 TMEV 균주의 부분 표본을 가져옵니다. 바이러스를 해동하고 얼음 위에 보관하십시오. 바이러스를 해동했다가 다시 얼리지 마십시오. 주사기에 바이러스 현탁액(20μL의 인산염 완충 식염수[PBS] 또는 Dulbecco의 변형된 이글 배지[DMEM] 배양 배지에 희석된 3 x 105 플라크 형성 단위[PFU])을 로드합니다.
      주의: 이 바이러스는 생쥐에게는 전염되지만 인간에게는 전염되지 않습니다.
    2. 소독제로 벤치를 청소하고 흄 흡수 장치 아래에서 작업하십시오. 바이러스 접종은 무균이 아니라 가능한 한 깨끗합니다.
    3. 마우스를 마취 유도실로 옮기고 산소 중 2% 이소플루란을 사용하여 마취를 유도합니다. 외과적 내성에 도달하는 데는 몇 분이 걸립니다. 동물의 호흡과 마취 깊이에 따라 농도를 조정합니다.
    4. 마취된 마우스를 후드 아래의 마취 상자에서 옮깁니다. 예를 들어 발가락 꼬집음으로 수술 내성을 확인합니다. 전체 절차는 30초 이내에 수행되므로 동물은 주사 중에 이소플루란을 흡입할 필요가 없습니다. 각막의 건조를 방지하기 위해 안쯔줄을 첨가하십시오.
    5. 알코올 패드로 동물의 머리를 청소하십시오. 주사 부위가 위쪽을 향하도록 마우스의 머리를 약간 왼쪽으로 기울입니다.
    6. 피부를 약간 뒤로 당기고 바늘을 머리에 삽입하고 우반구의 측두 영역(오른쪽 눈의 후방 및 내측)의 측두부 2.5mm 깊이까지 피질내로 20μL를 주입합니다.
    7. 모든 동물에서 동일한 반구에서 일방적으로 주입을 수행합니다. 눈과 귀를 두정엽 피질의 위치에 대한 이정표로 사용하십시오. 배치는 이전에 조직학적으로 검증되었습니다. 그림 1을 참조하십시오. 브레그마와 관련된 입체성 주입에 따른 주입 좌표는 -2.0(AP)입니다. +3.0 (ML); −1.5(DV).
    8. 주사기를 5-15초 동안 그대로 두십시오. 주입으로 인한 누출이 있거나 기포가 보이면 기록하십시오 - 이 경우 새 주사기를 준비하십시오. 주사기를 조심스럽게 당길 때 약간 회전시킵니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 안연
      9. 고를 바르십시오.
    9. 선택 사항: 현지 절차에 따라 동물의 꼬리나 귀에 코드를 지정합니다(선택 사항이지만 동물이 의식이 없기 때문에 쉽습니다).
    10. 마취에서 회복하는 동안 가열 패드(35-40 °C)를 반쯤 켤 덧씌우거나 반쯤 뺀 새 케이지로 동물을 옮깁니다. 동물이 흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 방치하지 마십시오.
      메모: 동물은 회복 후 다시 집단 수용될 수 있습니다(감염된 동물은 모의 감염된 동물과 섞이지 않습니다). 감염된 마우스는 감염되지 않은 마우스와 같은 방에 수용해서는 안 됩니다.
    11. 감염 후 첫 7일 동안 생쥐의 체중을 추적하면 감염 후 체중이 감소하고 추가 먹이가 필요할 수 있습니다.

2. 취급으로 인한 발작의 발작 모니터링

  1. 이 절차는 치료에 대해 맹검 한 실험자가 수행합니다. 모든 케이지를 벤치로 가져오세요. 가벼운 단계에서 하루에 2번 동물의 발작을 관찰하십시오.
  2. 수정된 라신 척도로 발작 활성도를 점수화합니다: 0 = 행동 변화 없음, 1 = 입과 얼굴 움직임, 2 = 고개를 끄덕임, 3 = 편측 앞다리 간대, 4 = 양측 앞다리 간대성, 5 = 자세 긴장도 상실을 동반한 일반화된 긴장-간대성 활동, 때때로 점프, 6 = 장기적이고 과도한 점프 및 과잉 행동. 발작의 횟수와 강도를 보고하십시오.
  3. 케이지를 가로질러 펜을 밀어 소리를 냅니다.
  4. 각 동물을 다른 상자로 옮겼다가 다시 돌려줍니다.
    5. 앞뒤로 움직여
  5. 케이지를 부드럽게 흔들고, 동물이 케이지의 측면이나 상단에 부딪혀 신체적 부상을 입을 위험이 있을 정도로 케이지를 너무 세게 흔들지 않도록 주의하십시오.
  6. 우리 안의 모든 동물이 발작을 일으키는지 모니터링합니다. 언제든지 쥐가 발작을 일으키면 집 케이지로 다시 옮기고 소음이나 취급에 의한 추가 발작 자극 없이 발작 정도를 기록하십시오.
  7. 자발적으로 발작을 일으키지 않거나 우리를 부드럽게 흔든 후에 발작을 일으키지 않은 동물의 경우, 더 강한 조작으로 발작을 유발합니다: 쥐의 꼬리를 왼쪽에서 오른쪽으로 뒤집어 조심스럽게 뒤집습니다.
    메모: 발작이 있는 동물은 과도하게 흥분하고 흥분할 수 있습니다.
  8. 각 동물의 발작 행동을 다시 관찰하십시오. 후속 케이지에 대해 이 과정을 반복합니다.

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결과

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그림 1: TMEV 주입 절차의 개략도. 왼쪽에서 오른쪽으로: 우측 두정엽 피질 주사의 경우 눈과 반대쪽 귀 사이의 가상선에서 약간 옆쪽으로 바늘을 주입합니다. 깊이 조절을 위한 칼라는 노란색으로 표시됩니다. 주사관은 화살표로 표시된 관상 뇌 섹션에서 볼 수 있습니다. 주입 부위는 화살표 위에 주어진 좌표에 해당합니다. 오른쪽 이미지는 해마 형성의 CA1 내에서 Theiler 바이러스(보라색)의 분포를 보여줍니다. 그림은 biorender.com 사용하여 준비되었습니다.

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공개 사항

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이해 상충이 선언되지 않았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
동물의 균형Ohaus (파시파니, 뉴저지, 미국)STX22020.01g–2200g
BD Lo-Dose U-100 인슐린 주사기BD (캐나다 온타리오주 미시소거) BD329461영구 BD Micro-Fine IV 바늘이 있는 Lo-Dose 멸균 주사기 - 1mL
다니엘의 TMEV 변형로버트 후지나미(Robert Fujinami, 유타 대학교)-3 x 105 플라크 형성 단위 분취
소독제(예: VennoVet 1 super)Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, 독일-캠퍼스 수의사가 권장하는 알코올 농도는 5% 이하입니다.
Fisherbrand 미디엄 멸균 알코올 준비 패드 C7 Thermo Fisher Scientific(미국 매사추세츠주 월섬)전화: 22-363-750
플루리소VETone (보이시, ID, 미국)502017이소플루란 250mL, 2%–5%
흄 흡수제 Labconco (미국 미주리주 캔자스시티)--
일반 보호 일회용 SMS 화이트 실험실 코트 Thermo Fisher Scientific(미국 매사추세츠주 월섬)제17-100-810호
얼음 양동이--어떤
마우스 케이지--최소 5마리의 마우스를 수용하는 모든 마우스 케이지
PrecisionGlide 바늘 BD (캐나다 온타리오주 미시소거)329652BD 슬립 팁(PrecisionGlide 바늘 인슐린 주사기 포함) - 26 g x 3/8 - 0.45 mm x 10 mm
Self-Sealing 살균 파우치 Fisher Scientific (미국 뉴욕주 햄프턴)NC9241087 12.6 x 25.5 cm
작은 유리 플라스크--any, 용량 25 mL
멸균 PBSThermo Fisher Scientific(미국 매사추세츠주 월섬)10010056
주사기 Luer-LokBD (캐나다 온타리오주 미시소거)3096281mL 주사기만 해당
초음파 세척기, 히터/기계식 타이머Cole-Parmer (미국 일리노이주 버논 힐스)EW-08895-23수조 초음파 처리기 - 0.5 gal, 115 V
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