동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 리소포스파티딜콜린(LPC) 용액 준비
- 250μL의 클로로포름과 메탄올 혼합 용액(1:1)에 25mg의 LPC 분말(재료 표 참조)을 용해하여 10% LPC 용액을 만들고 500μL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
참고: LPC가 완전히 용해되지 않은 경우 원심분리기 튜브를 초음파 세척기에 넣고 40kHz에서 ~1시간 동안 초음파처리하여 균일한 용액을 얻습니다.
- 용액을 3 μL/튜브로 나누고 -80 °C에서 보관합니다.
참고: 솔루션은 ~2년 동안 보관할 수 있습니다.
- 수술 전, 0.9% 염화나트륨(NaCl) 용액 27μL로 용액을 희석하고(1.2단계) 37°C의 항온 수조에 보관합니다.
참고: 주입을 시작하기 직전에 용액을 준비합니다.
2. 수술 준비
- 32G, 2인치 바늘을 사용하여 5μL 주사기에 연결합니다(재료 표 참조). 마이크로리터 주사기가 막히지 않았는지 확인하십시오. 주입을 준비하기 위해 5μL의 LPC 용액을 회수합니다.
- 3% 이소플루란과 100% 산소를 혼합한 이소플루란 기화기에 연결된 유도 챔버에서 약 0.3L/분의 속도로 마우스를 마취합니다.
- 호흡이 원활한 동안 발가락 꼬집음 반사가 부족하여 마취 깊이를 확인합니다.
- 전기 면도기를 사용하여 귀 사이로 마우스의 머리를 면도합니다. 시술 중 각막 건조를 방지하기 위해 윤활 안약을 바르십시오.
- 그런 다음 등쪽이 위로 향하게 하여 입체 프레임(재료 표 참조)에 마우스를 배치하고 노즈 콘과 치아 클램프로 머리를 고정합니다. 코를 통해 1.2%-1.6% 이소플루란으로 마취를 유지합니다.
참고: 이소플루란 농도는 마우스의 호흡 상태에 따라 조정할 수 있습니다.
3. 외과적 절차
참고: 동물은 모든 절차 중에 발열 패드에 놓습니다.
- 양쪽 이어바가 있는 입위 장치에 마우스를 고정합니다. 이어바가 수평이고 머리가 수평이고 안정적인지 확인하십시오.
- 요오드로 머리 피부를 여러 번 닦은 다음 알코올을 원을 그리며 닦아 소독합니다. 그런 다음 메스를 사용하여 두피 정중선을 따라 약 1.5cm의 작은 절개를 잘라 두개골을 노출시킵니다.
- 1% 과산화수소에 적신 면봉으로 브레그마, 람다, 후방 천문이 드러날 때까지 두개골을 닦습니다. 주사기를 입체식 장치에 놓습니다.
참고: 과산화수소는 주의해서 사용하고 주변 조직을 만지지 마십시오.
위치 - 동물의 머리가 수평으로 배치되도록 합니다(앞뒤, 왼쪽과 오른쪽 모두).
- 입체 프레임의 Z축 손잡이를 조정하여 바늘 끝과 두개골이 구부리지 않고 닿도록 한 다음 Z축 좌표를 측정합니다. 브레그마와 후방 천문의 Z 좌표를 확인합니다.
- 브레그마와 후방 천문의 Z 좌표 차이가 0.02mm를 넘지 않도록 이어바를 조정합니다. 그런 다음 동일한 방법에 따라 중앙선의 왼쪽과 오른쪽에 있는 해당 위치의 Z 좌표를 측정합니다. 이어바를 조정하여 왼쪽과 오른쪽이 같은 높이에 오도록 합니다.
- corpus callosum을 찾습니다. XYZ 원점을 브레그마로 설정합니다.
참고: 첫 번째 주사 부위는 브레그마 측면 1.0mm, 깊이 2.4mm, 전방 1.1mm입니다. 두 번째 주사 부위는 브레그마 측면 1.0mm, 깊이 2.1mm, 전방 0.6mm입니다. 예를 들어, 브레그마의 좌표는 (0,0,0)입니다. (-1, 1.1, X) 및 (-1, 0.6, Y)로 표시된 해당 위치의 Z 좌표를 측정합니다. 말뭉치의 1차 주입 부위 좌표는 (-1, 1.1, -[X + 2.4])이고, 두 번째 주입 부위는 (-1, 0.6, -[Y + 2.1])로 확인할 수 있습니다.
- 주사 부위가 결정되면 두개골에 멸균 마커로 표시하고 좌표를 기록합니다.
- 두개골 드릴로 표시된 부위를 부드럽게 뚫습니다(재료 표 참조). 출혈이 발생하지 않도록 주의하십시오.
- 바늘을 주어진 좌표로 천천히 움직이고 주입을 시작하십시오. 말뭉치 탈수초화를 유도하려면 각 주입 부위(3.5단계)에 0.4μL/분의 속도로 2μL의 LPC 용액(1.2단계)을 주입합니다.
- 주사 후 각 부위에 바늘을 10분 더 유지합니다.
참고: 두 번의 주입 간격이 20분을 넘지 않도록 하십시오.
- 4-0 봉합사로 피부를 봉합하고 동물이 10분 이내에 깨어날 때까지 기다립니다. 제도적 동물 관리 규정에 따라 수술 후 진통제를 투여합니다.
참고: 안락사 권장 시기는 실험의 목적에 따라 결정될 수 있습니다.