헤모글로빈의 뇌실 내 주사를 통한 신생아 심실 내 출혈 모델링

초록

출처: Miller, B. A., et al. 헤모글로빈의 뇌실 내 주사를 통한 신생아 뇌실 내 출혈 모델링. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 신생아 뇌실내 출혈의 랫트 모델을 생성하는 방법을 보여줍니다. 이 절차에서는 마취된 새끼 쥐에게 헤모글로빈을 뇌의 외측심실에 주입합니다. 헤모글로빈은 산화 스트레스를 유발하고 헴을 방출하여 뇌실 내 출혈을 시뮬레이션합니다. 활성 산소종과 염증성 사이토카인에 의해 유발되는 뇌 조직의 손상은 심실 내 출혈의 흔한 결과인 심실 비대를 유발합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 헤모글로빈 및 CSF 용액의 제조

1. 1.5mL 마이크로튜브에 aCSF 용액 500μL를 첨가하여 멸균 인공 뇌척수액(aCSF) 용액을 준비하고 얼음에 보관합니다.
2. 1.5mL 마이크로튜브에 500μL의 aCSF에 75mg의 헤모글로빈을 첨가하여 멸균 150mg/mL 헤모글로빈 용액을 준비하고 얼음에 보관합니다.

2. 주사를 위한 동물의 준비

1. 쥐의 체온을 유지하기 위해 가열 패드를 중간 설정으로 돌립니다.
2. 출생 후 4일차(P4) 쥐를 3% 이소플루란으로 채워진 유도실에서 마취합니다.
   참고: 15분마다 발가락/꼬리 꼬집음 반응을 사용하여 충분한 마취를 확인하십시오. 조직 색상, 체온 및 호흡수에 대한 육안 관찰을 통해 마취를 모니터링합니다.
3. 마취된 쥐에게 5mg/kg의 피하 카프로펜 주사로 통증 완화제를 투여합니다.
4. 마취된 쥐를 엎드린 상태로 정위 장치에 엎드려 코를 1.5% 이소플루란의 일정한 흐름으로 마취 어댑터에 위치시킵니다.
5. 머리를 고정하기 위해 외이도의 파열 방지 이어바를 조입니다.
   참고: 주사 시점에 눈을 뜨고 있는 경우 눈을 촉촉하게 유지하기 위해 수의사 연고를 바르십시오.
6. 베타딘과 70% 에탄올에 적신 멸균 면봉 어플리케이터를 번갈아 가며 머리를 청소합니다.
   1. 베타딘에 적신 어플리케이터를 두피 중앙에 대고 베타딘을 원을 그리며 펴 바깥쪽으로 움직입니다.
   2. 에탄올에 적신 애플리케이터로 2.6.1.1단계를 반복합니다.
   3. 2.6.1.1 단계와 2.6.1.2 단계 3x.
   를 반복합니다.
7. 수술 부위를 보호하기 위해 멸균 수술용 드레이프를 적용합니다.
8. 멸균 메스를 사용하여 머리 중앙을 수직으로 0.3cm 절개하여 두개골의 브레그마를 노출시킵니다.
   참고: 람다에서 주입하는 경우 브레그마 대신 두개골의 람다를 노출시킵니다.
9. 멸균 면봉 어플리케이터를 사용하여 해당 부위를 말리십시오.

3. 정위 인젝터 설정

1. 1.2단계에서 준비한 헤모글로빈 용액을 30G 바늘이 있는 0.3mL 멸균 주사기에 넣고 주사기를 정위 주입기 시스템에 넣습니다.
   참고: 대조 조건을 생성하는 경우 1.1단계에서 준비한 CSF 용액을 0.3mL 멸균 주사기에 추출하고 프로토콜을 진행합니다.
2. 정위 주입기 인터페이스를 켜고 구성 버튼을 클릭하여 주입량 및 속도 설정을 입력합니다. 위치
   1. 볼륨 을 클릭하고 볼륨을 20,000 nL (20 μL)로 설정합니다.
   2. 주입 속도를 클릭하고 속도를 8,000 nL/min (8 μL/min)으로 설정합니다.
3. 위치 재설정 버튼을 클릭하여 구성 을 종료합니다.
4. 바늘 끝에서 작은 헤모글로빈 용액 구슬이 나올 때까지 Infuse 버튼을 클릭하여 바늘 끝을 씻어냅니다.
5. 멸균 솜 팁 어플리케이터로 바늘 끝에서 헤모글로빈 용액을 부드럽게 흡수합니다.

4. 동물주사

1. 주사기의 내측 및 전후 위치를 조정하여 정위 주입기 시스템에서 브레그마 를 0 으로 설정한 후 플러시된 주사기 바늘 끝을 내려 브레그마의 두개골을 부드럽게 만집니다.
   참고: 람다에서 주입하는 경우 lambda 를 0으로 설정합니다.
2. 선택한 좌표를 식별합니다.
   1. 브레그마에서 주사하는 경우, 여기에 설명된 P4 쥐 에서 브레그마에서 1.5 mm, 0.4 mm 전방, 2.0 mm 깊이를 사용합니다.
   2. 람다에서 주입하는 경우 P4 랫트에 대해 람다에서 측면 1.1mm, 전방 4.6mm, 깊이 3.3mm 좌표를 사용합니다.
3. 주사기 바늘을 두개골 위로 1cm 올려 두피를 청소합니다. 주사기가 올라오면 내측 및 전후 좌표 설정을 진행합니다.
4. 주사기 바늘을 내려 두개골을 부드럽게 만집니다. 바늘이 두개골에 닿는지 확인하십시오.
5. 30초 동안 배복부 좌표를 설정합니다.
   참고: 배복부 좌표를 설정하는 동안 바늘은 두개골에 구멍을 뚫습니다. 주사기가 두개골을 변형시키지 않고 두개골을 통과하도록 주의해야 합니다. 두개골 변형은 변형이 발생하면 배복부 좌표를 따라 바늘을 천천히 빼낸 다음 동일한 궤적을 따라 바늘을 다시 놓음으로써 피할 수 있습니다. 이렇게 하면 바늘이 더 적은 힘과 변형 없이 두개골의 구멍을 통과할 수 있습니다.
6. 정위 주입기 인터페이스에서 실행 버튼을 클릭하여 주입을 시작합니다.
7. 주입이 완료된 후 용액의 역류를 최소화하기 위해 주사기 바늘을 2분 동안 제자리에 두십시오.
8. 바늘 끝이 두피에서 2cm 위에 올 때까지 2분에 걸쳐 배복부 좌표를 따라 주사기를 천천히 빼냅니다.
9. 정위 인젝터 암을 작동 필드에서 멀리 돌립니다.

5. 수술 후 관리

1. 6-0 모노필라멘트 봉합사로 두피를 닫습니다. 0.3cm 절개 부위 중앙에 간단한 단속 봉합사를 한 번 만듭니다.
2. 강아지를 마취에서 제거하고 가열 패드의 안전한 영역에 놓습니다.
3. 설치류를 가정용 케이지로 되돌려 댐의 보살핌하에 마취에서 회복하십시오.
   참고: 댐 관리로 적시에 복귀하면 수술 후 조기 사망률이 줄어듭니다.
4. 수술 후 3시간 동안 오른쪽 반사 상실로 동물의 마취를 모니터링합니다.
5. 7일 동안 매일 동물의 정상적인 활동, 음식 섭취 및 체중 증가를 모니터링하십시오. 절개 부위를 모니터링하여 상처 치유, 봉합 및 수술 부위의 털이 다시 나타나는지 확인합니다.
   참고: 모니터링 중 발작, 중추 우울증 또는 식욕 감소와 같은 신경학적 변화가 관찰되는 드문 경우, 마취 하에 혈관 내 관류 또는 경추 탈구를 사용하여 동물을 안락사시킵니다.
6. 봉합사가 닫히고 상처가 치유된 후 감염을 예방하려면 절개 부위에 국소 삼중 항생제를 바르십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.3mL 인슐린 주사기	BD 마이크로파인 + 인슐린 주사기	230-4533	0.3-0.5 mL 신링이 작동합니다
1.5mL 마이크로튜브	미국 과학	1615-5500	로트 번호 K194642H -3 511
6-0 모노필라멘트 봉합사	에티콘	667지
분석 저울	CCURIS 기기	W3200-320
인공 뇌척수액(aCSF)	토크리스 바이오사이언스	3525	배치 번호: 72A
베타딘	퍼듀 프로덕츠 L.P.	301005-00	NDC 67618-150-09
카르프로펜 (주사용 가능)	(주)조에티스	PI 4019448	리마딜
에탄올	데콘 연구소	2701
발열 패드	태양광선	E12107-819	UL 612A, Z-1228-001
헤모글로빈	MP 바이오메디컬	100714	로트 번호 SR02321
이소플루란	피라말 중환자 치료	확인서 66794-017-25
이소플루란 기화기	베테텟	911103
입체 기구를 위한 조명	돌란-제너 산업	파이버-라이트 MI-150
미세주입 주사기 펌프	세계 정밀 기기	MICRO21	시리얼 184034 T08K
산소	에어가스 헬스케어	UN1072	로트 번호 S1432080XA02
스프라그 돌리 쥐	찰스 리버 연구소	스트레인 코드: 001
정위 악기	KOPF 시설	모델 900LS 게으른 수잔
멸균 면 팁 어플리케이터	피셔브랜드	23-400-118
수술용 칼날	코브트러스	#10
국소 삼중 항생제	삼중 항생제 연고	NDC 51672-2120-1