Triggering and Monitoring heat-induced seizure in a Transgenic Mouse 모델

초록

출처: Das, A., et al. 간질의 마우스 모델에서 열 유도 발작에 대한 행동 스크리닝. J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오는 간질 관련 유전자 돌연변이가 있는 형질전환 마우스에서 통제된 챔버에서 체온을 서서히 증가시켜 열 유도 발작을 유도하는 절차를 보여줍니다. 이 프로토콜은 간질에 대한 발작 메커니즘과 잠재적 치료법을 연구하는 데 사용됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 열유발발작분석법 준비

1. 히트 챔버에서 Power On 버튼을 켠 다음 Heat On 버튼을 켭니다.
2. 디지털 온도 컨트롤러의 키패드를 사용하여 가열 챔버의 온도를 50°C로 설정합니다.
3. 첫 번째 마우스를 챔버에 도입하기 전에 챔버를 50°C로 예열할 때까지 최소 1시간 동안 기다립니다. 예열은 챔버 내부의 균일한 가열을 보장합니다.
4. 마우스 가열 챔버의 바닥에 개암 나무 속 침구를 깔아줍니다.
5. 가열 챔버 앞에 비디오 녹화 카메라를 장착하여 각 열 유도 발작 분석 시험을 녹화합니다.
6. 직경 140mm의 페트리 접시에 두꺼운 티슈 페이퍼를 깔고 얼음 위에 올려 냉각 패드 역할을 합니다.
   참고: 분석이 끝나면 개별 마우스는 상승된 체온을 낮추는 데 도움이 되도록 사전 냉각된 냉각 패드로 옮겨집니다.

2. 열 유도 발작 분석을 위한 마우스 준비

1. 열 유발 발작 스크리닝 분석을 위해 10마리의 성체 마우스(P30-P40), 간질을 유발하는 돌연변이를 가진 5마리, 야생형 깔짚 짝 5마리를 선택합니다.
   참고: 간질을 유발하는 돌연변이가 없는 야생형 마우스는 44°C 미만의 온도에서 열로 인한 발작을 나타내지 않으며 대조군 역할을 합니다.
2. 스크리닝 분석에 사용할 각 마우스의 무게를 측정하고 체중을 기록합니다. 무게가 15g 이상인 마우스만 분석에 사용해야 합니다.
3. 마우스 가열 챔버에서 한 번에 하나의 마우스를 스크리닝합니다.
4. 벨 항아리 바닥에 이소플루란 몇 방울을 사용하여 10-15초 동안 마우스를 잠시 마취합니다.
5. 방울 항아리에서 동물을 꺼내 종이 타월 위에 올려 놓습니다.
6. 마우스가 유해한 발가락 꼬집음에 반응하지 않는지 확인하여 마우스가 완전히 마취되었는지 확인하십시오.
7. 직장 온도 프로브의 금속 팁에 윤활제(예: 바셀린)를 바르고 2cm 이하의 깊이에서 마우스에 부드럽게 삽입합니다.
8. 직장 프로브를 테이프로 마우스의 꼬리에 고정하여 분석 중에 프로브가 나오지 않도록 합니다.
   참고: 또는 동물을 마우스 구속 원뿔에 넣고 직장 온도 프로브를 삽입합니다. 꼬리에 테이프로 고정하십시오.
9. 직장 프로브가 마우스의 내부 체온을 표시하는 멀티미터에 연결되어 있는지 확인하십시오.
10. 동물을 개암 나무 속삭임이 깔린 새 우리, 즉 회복 케이지에 넣습니다.
11. 타이머를 시작하고 5분 동안 기다립니다. 마우스가 마취에서 완전히 회복되고 마우스가 활동적이고 그루밍할 때까지 마우스를 관찰합니다.
    1. 동시에 35-36 °C에서 안정화될 때까지 마우스의 심부 체온을 모니터링합니다.
12. 5분이 지나면 마우스의 체온을 확인합니다. 이것은 시간 "0"분에서의 초기 체온입니다.
    위치 참고: 마우스의 심부 체온이 35 °C 미만인 경우 동물이 마취로 인한 저체온증에서 회복할 때까지 추가 시간을 기다립니다.
13. 개별 마우스를 예열된 마우스 챔버로 빠르게 옮깁니다. 이것은 실험 시험의 시작을 표시합니다. 주어진 시간에 하나의 마우스만 스크리닝됩니다.

3. 열유발 발작 분석

1. 예열된 마우스 가열 챔버의 바닥에 마우스를 부드럽게 놓은 후 플렉시 유리 도어를 닫고 실험 비디오 녹화를 위해 카메라를 시작합니다.
2. 스톱워치를 시작합니다. 실험 기간 동안 1분 간격으로 직장 체온계에서 마우스의 체온을 기록합니다.
3. 일정한 간격으로 마우스 가열 챔버의 온도를 높여 마우스의 체온이 0.25-0.5 °C/min.
   의 비율로 증가하도록 합니다. 참고: 체온의 급격한 상승은 열사병이나 사망으로 이어질 수 있으므로 피해야 합니다.
4. 이 프로토콜에 따라 그림 1A와 같이 10분마다 마우스 가열 챔버의 온도를 5°C씩 높입니다.
5. 9.5분에서 가열 챔버의 온도를 55°C로 설정하고 디지털 온도 디스플레이에 표시된 대로 55분까지 가열 챔버의 온도를 10°C로 안정화합니다.
6. 마찬가지로, 19.5분에 온도를 60°C로 상승시켜 20분까지 가열 챔버의 온도를 60°C로 안정화합니다. 각 발작 선별 검사는 30분 동안 지속됩니다.
7. 마우스가 발작을 일으키면(발성, 머리 끄덕임 표시, 앞다리 간막, 뒷다리 신전, 옆으로 넘어지거나 전신 긴장/간대 경련을 경험함) 다음 정보를 기록하십시오.
   1. 직장 체온 온도계에서 발작 중 마우스의 체온(발작 역치 온도)을 기록합니다.
   2. 머리가 끄덕이는 것, 앞다리 간대질, 뒷다리 신전, 옆으로 넘어지는 것 및/또는 마우스가 표시하는 전신 긴장성/간대성 발작(GTCS)과 같은 발작 행동 특성을 기록합니다.
8. 챔버에서 마우스를 빠르고 부드럽게 들어 올려 1.6단계에서 준비한 냉각 패드에 놓습니다.
   참고: 쥐가 라신 스케일 5 발작을 일으키고 통제할 수 없는 점프를 보인다면, 열실에서 동물을 들어올려 외부의 냉각 패드로 옮기는 것이 어려울 수 있습니다. 그러나, 전형적인 열 유도 발작은 30 초에서 60 초 사이에 지속됩니다.따라서, 마우스는 열 챔버에서 꺼내 열 유도 발작 에피소드 시작 후 60 초 이내에 냉각 패드에 올려 놓아야합니다.
9. 마우스 체온이 36-37 °C로 내려갈 때까지 기다렸다가 복구 케이지로 옮기십시오. 한 번에 하나의 마우스만 복구 케이지에 넣습니다.
   참고: 아직 열 유도 스크리닝에 사용되지 않은 마우스와 이미 열 유도 발작 실험 시험을 경험한 마우스를 혼합하지 마십시오.
10. 부드럽고 조심스럽게 가위로 마우스 꼬리와 직장 프로브 와이어 사이의 테이프를 잘라 마우스에서 직장 프로브를 제거합니다.
11. 직장 프로브의 금속 끝을 70% 알코올과 연조직 물티슈로 닦아 다음 시험을 준비할 수 있도록 합니다.
12. 마우스를 홈 케이지로 되돌리기 전에 정상적인 활동(걷기, 그루밍 등)을 재개할 때까지 복구 케이지에서 마우스를 계속 관찰합니다. 이것은 이 마우스에 대한 실험 시험의 끝을 표시합니다.
13. 분석 후 동물 상태를 기록하십시오-살아 있고 테스트 세션에서 회복되었거나 죽었는지 여부. 통제되지 않은 점프 및 전신 긴장/간대성 발작을 포함하는 고강도 발작은 때때로 마우스의 죽음을 초래할 수 있습니다.
14. 30분의 관찰 기간 내에 마우스가 열로 인한 발작을 일으키지 않거나 마우스의 체온이 44°C에 도달하면 가열 챔버에서 마우스를 제거하고 마우스의 체온이 36-37°C로 돌아올 때까지 냉각 패드에 올려 놓습니다.
15. 마우스 가열 챔버의 온도를 50°C로 재설정하고 디지털 온도 컨트롤러의 디스플레이 온도가 50°C를 표시할 때까지 평형을 유지합니다.
16. 개별 마우스 시험 사이에 cob bedding을 변경합니다.

결과

그림 1: 돌연변이 마우스는 열 유도 발작을 보입니다. (A) 생쥐의 열 유발 발작의 행동 선별을 위한 가열 프로토콜. (B-C) 각각 두 개의 유전적 배경 129X1 및 B6N에 있는 야생형(Scn1a+/+ - 검은색 삼각형) 및 이형접합 돌연변이(Scn1aKT/+ - 주황색 원) 마우스에서 시간에 따른 마우스의 평균 체온. (D) 두 유전적 배경에서 열 유발 발작을 보이는 마우스의 비율. 야생형(Scn1a+/+) 및 이형접합성(Scn1aKT/+) 마우스는 각각 검은색과 주황색 막대로 표시됩니다. 129X1 및 B6N 배경의 이형접합 돌연변이는 각각 주황색...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
축 방향 팬	파르남	AF20-200-120-xx10-3.1	Farnam 맞춤형 제품 -팬이 있는 축 팬 히터
디지털 온도 컨트롤러	잉크새	ITC-100RH	K 열전대가 있는 Inkbird 디지털 PID 온도 컨트롤러 ITC-100RH
마우스 직장 온도 프로브	써모웍스, 브레인트리 사이언티픽	레트-3	온도계가 있는 마우스 직장 온도 프로브