쥐 해마 절편에서 중간뉴런의 면역염색

초록

Swietek, B., et al., 신경화학적 마커에 대한 바이오사이틴 충전 및 가공 절편의 면역염색. J. Vis. 특급 (2016년)

이 비디오는 쥐 해마 절편에서 바이오사이틴으로 채워진 인터뉴런을 시각화하는 과정을 보여주며, 특정 항체 및 형광 현미경을 사용하여 신경화학적 정체성을 강조합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 1차 항체 및 바이오사이틴 염색

(1일차)
참고: 다음 면역염색 절차는 자유 부동 절편에 대한 것이며 모든 배양 단계에서 shaker에서 저속(2회전/분, rpm)으로 연속 진탕해야 합니다.

1. 0.1 M PBS (PH = 7.4)에서 각각 10 분 동안 조직을 3x 세척하십시오 .
   참고 : 0.1 M PBS는 다음과 같이 상업적으로 구매하거나 실험실에서 만들 수 있습니다 (1 L 제작) : NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na₂HPO₄ 1.44 g 및 KH₂PO₄ 0.24 g in 1 L dH₂O.
   메모: 원하는 신경화학적 마커를 알고 있는 경우, 단백질/펩타이드에 대한 염색을 바이오사이틴 염색과 동시에 수행할 수 있습니다(1.2 - 1.4단계). 바이오사이틴만 염색하는 경우 1.5단계로 진행합니다.
2. 선택 사항: 10% 차단 혈청(BS, PBS에서 0.3% Triton X-100에 희석된 일반 염소 혈청(NGS)으로 RT에서 1시간 동안 차단).
   메모: 각 웰은 동일한 부피의 용액을 받아야 합니다. 권장 부피는 250 - 500 μL/well입니다. 차단 혈청의 선택은 2차 항체가 발생하는 종을 기반으로 합니다(예: NGS는 염료 접합 염소 항(각 1차 항체 종)에 사용됨). 면역염색 절편을 위해 다른 종에서 생성된 2차 항체를 사용해야 하는 경우, 차단 단계(2)에 각 정상 혈청의 10%를 포함하고, 1차 및 2차 항체 배양 단계에 각 정상 혈청의 3%를 포함시킵니다.
3. (선택 사항) 1 차 항체 CB₁R (다클론, 기니피그)의 절편을 RT O/N. 0.1 M PBS에서 0.3 % Triton X-100 및 3 % BS와 함께 배양합니다. CB₁R은 칸 나비 노이드 수용체 유형 1 발현을 식별하는 데 사용됩니다 .
   메모: 이 단계는 선택 사항이며 바이오사이틴 충전을 밝히는 데 필요하지 않습니다. 그림 2는 첫 번째 염색 과정에서 biocytin과 CB₁R에 대해 표지된 섹션을 보여줍니다. RT에서 O/N 배양은 대부분의 1차 항체에 충분합니다. 그러나, CB₁R을 포함한 특정 1차 항체는 3 - 5 d의 배양을 필요로 한다. 배양이 1d보다 길어야 하는 경우 Triton X-100이 조각을 투과화할 수 있고 실온에서 장기간 배양하는 동안 조직이 분해될 수 있으므로 4°C에서 배양하는 것이 좋습니다. 2차 항체의 특이성에 대한 대조군으로 각 일련의 실험에 대해 적어도 하나의 섹션에 1차 항체가 없는 음성 대조군을 포함합니다. 음성 대조군의 경우 1차 항체는 생략되지만 0.1M PBS 및 BS에 포함된 0.3% Triton X-100이 추가됩니다.

(2일차)

1. 0.1M PBS(pH = 7.4)에서 각각 10분 동안 뇌 섹션을 3회 세척합니다.
2. streptavidin red dye conjugate(농도: 1:1,000, 여기: 가시적 적색 스펙트럼에서 방출되는 594nm)에서 암흑 속 4°C O/N(알루미늄 호일로 포장)에서 0.3% Triton X-100 및 0.1M PBS의 3% BS로 절편을 배양하여 biocytin을 나타냅니다. 선택적: 2차 항체인 염소 항기니피그(농도: 1:500, 여기: 488nm 및 녹색 방출)를 포함하고, 1.3.
   단계에서 선택적인 1차 배양에 이어 위의 배양을 수행합니다. 메모: 2차 항체는 선택적인 1차 항체 염색(1.3단계)이 수행되는 경우에만 필요합니다. 바이오사이틴을 시각화하기 위해서는 방출 스펙트럼이 빨간색으로 표시된 스트렙타비딘-플루오로포어 접합체를 사용하는 것이 좋은데, 이는 더 미세한 축삭돌기를 더 세밀하게 시각화하고 더 나은 대비로 시각화하는 데 도움이 되기 때문입니다(그림 1 - 3).

(3일차)

1. 0.1M PBS(pH = 7.4)에서 각각 10분 동안 뇌 절편을 3회 세척합니다.
2. 형광을 보호하고 향후 재염색을 용이하게 하려면 수성 기반 장착 매체에 섹션을 장착하고 투명 매니큐어로 커버슬립의 가장자리를 밀봉합니다.
   메모: 슬라이드에서 매니큐어를 제거하는 어려움, 곰팡이 침입 및 유리 슬라이드에서 누출되는 장착 매체로 인한 조직 탈수를 피하기 위해 가능한 한 빨리 섹션을 다시 염색하는 것이 가장 좋습니다. 미생물 오염은 PBS.
   에 0.02% 아지드화나트륨을 사용하여 예방할 수 있습니다. 주의: 아지드화나트륨은 물과 접촉할 때 독성이 강하고 가연성이 높습니다. 유해 화학 물질의 취급 및 폐기에 대한 표준 작업 절차를 참조하십시오.
   (4일차 - 7일차)
3. 594 및 488 nm에서 여기(excitation)와 20X 또는 40X 배율로 컨포칼 이미징을 수행하여 바이오사이틴으로 채워진 뉴런을 빨간색으로, 신경화학적 마커(CB₁R)를 녹색으로 표시합니다. 공동 라벨링을 평가합니다(그림 2).
4. 카메라 노출을 100ms 미만으로 설정하여 광표백을 방지하고 전체 뉴런의 축삭돌기 및 수지상 가지의 공초점 이미지 스택을 얻을 수 있습니다. 컨포칼 이미지 스택과 뉴런 추적 소프트웨어 패키지를 사용하여 뉴런 형태를 재구성할 수 있습니다.

결과

그림 1. 바이오시틴 충전을 위해 세포에 접근하기 위한 제안 평면. 이 이미지는 기록 중 바이오사이틴으로 채워진 과립 세포(GC)를 보여주며, 이는 바이오사이틴(594-conjugated streptavidin을 사용하여 빨간색으로 표시)을 나타내기 위해 처리되었습니다. GC는 XY 평면에서 방향이 지정된 수상돌기를 가지고 있습니다. XY 평면을 따른 피펫 이동으로 인해 절단된 과립 세포 축삭돌기(녹색 화살표)를 주목하십시오. 참고로, 이 뉴런은 XZ 평면을 따라 접근하는 것이 좋습니다. 눈금 막대 : 50 μm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염화나트륨	시그마	S7653	면역염색
KCL	플루카	60129	면역염색
인산수소이나트륨	시그마	S7907	면역염색
인산일칼륨	시그마	229806	면역염색
트리톤 X-100	시그마	T8787	면역염색
기니피그 안티 CB1	시그마	AF530-1	면역염색
스트렙타비딘, 알렉사 플루어 접합체	분자 프로브	S11227	면역염색
일반 염소 혈청	시그마	G9023	면역염색
벡타쉴드	벡터 랩	H-1000	면역염색
2차 항체	Invitogen 분자 프로브	Alexa Fluor 접합 염료	면역염색
랩넷 궤도 저속 쉐이커	바이오익스프레스	S-2030-LS	면역염색
겸자	뒤몽	11231-30	면역염색
슬라이드 폴더	EMS	71520	면역염색
바이오사이틴	시그마	B4261	전기생리학