인간 직장 흡입 생검 절편에서 S-100 단백질의 면역조직화학적 염색

초록

출처: Chi, S., Fang, et al. 칼레티닌, S100 단백질 및 단백질 유전자 제품 9.5에 대한 면역염색 직장 흡입 생검에 의한 히르슈스프룽병 진단. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오는 직장 흡입 생검 절편에서 S-100 단백질의 면역조직화학적 염색을 보여줍니다. 항원 채취 절편을 차단하고 1차 항체로 치료한 후 히르슈스프룽병의 지표인 S-100에 대한 2차 항체를 투여합니다. 발색 기질(chromogenic substrate)을 첨가하여 표적 세포를 염색합니다. 샘플은 현미경으로 시각화하기 전에 탈수 및 장착됩니다.

프로토콜

1. 직장 흡입 생검(RSB) 절편 준비

1. 직장 흡입 생검을 4% 파라포름알데히드에 6시간 동안 넣어 조직을 고정합니다. 조직 볼륨보다 5배 더 많은 정착량을 사용하십시오.
2. 병리학적 조직 탈수기를 사용하여 11시간 동안 조직을 탈수합니다. 프로그래밍된 전체 프로세스는 다음 5단계로 구성됩니다.
   1. 조직을 포름알데히드에 넣고 1시간 동안 고정합니다.
   2. 조직을 75% 에탄올에 4시간 동안 넣습니다.
   3. 조직을 절대 에탄올에 넣습니다(2회 변경, 각 1시간).
   4. 조직을 절대 에탄올에 넣습니다(2회 변경, 각 30분).
   5. 조직을 자일렌에 넣습니다(3회 변경, 각 1시간).
3. 조직을 파라핀 왁스 (58-60 ° C)에 놓습니다 (3 회 변경, 각 1 시간). RSB 조직을 파라핀 블록에 삽입합니다.
4. 조직이 완전한 단면면으로 완전히 노출될 때까지 마이크로톰을 사용하여 파라핀 블록을 다듬습니다.
5. 마이크로톰을 사용하여 블록을 0.4μm 섹션으로 자릅니다.
6. 섹션을 45-50°C의 물에 각각 몇 초 동안 배치하여 섹션이 평판으로 퍼질 수 있도록 합니다.
7. 파라핀 섹션을 슬라이드로 옮깁니다.
8. 60°C 오븐에서 3-5시간 동안 슬라이드를 굽습니다.항원이 손실될 수 있으므로 너무 오래 굽지 마십시오.
9. 파라핀이 제거된 슬라이드를 자일렌에 넣습니다(2회 변경, 각 15분).
10. 슬라이드를 절대 에탄올, 95%, 80% 및 75% 에탄올로 각각 5분 동안 수화합니다. 그런 다음 역삼투압(RO) 정제수로 5분 더 헹굽니다.

2. 항원 회수

1. 4mL의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 항원 회수 완충액을 200mL의 RO 정제수와 혼합하여 칼레티닌 회수를 위한 작업 희석액을 만듭니다. 1mL의 구연산 나트륨 시트레이트 버퍼(100x)와 99mL의 RO 정제수를 혼합하여 S100 및 Protein Gene Product 9.5(PGP9.5) 회수를 위한 작업 희석액을 만듭니다.
   참고: 칼레티닌은 EDTA 회수 용액에 의해 우선적으로 회수할 수 있습니다. 그러나 구연산 나트륨 시트레이트 완충액은 S100 및 PGP9.5의 검색에 더 적합합니다.
2. 슬라이드를 코플린 염색 용기에 넣습니다. 항아리에 회수 용액을 채우고 예열된 끓는 물 수조에 넣습니다. 20분 동안 끓인 후 수조에서 항아리를 꺼내 실온으로 식힙니다. 냉각 과정은 약 10분 정도 걸립니다. 슬라이드를 제거하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 한 번 부드럽게 헹굽니다.
3. 티슈 주위에 마커 펜으로 원을 그리고 다음 절차를 위해 젖은 상자를 준비합니다.

3. 블로킹

1. 3mL의 30% H₂O₂를 27mL의 RO 정제수와 혼합하여 작업 희석을 만듭니다.
2. 3% H₂O_{2 용액} 2-3방울을 조직에 떨어뜨려 과산화효소를 차단합니다. H₂O₂ 용액을 즉시 추가하여 원에서 넘치지 않도록 합니다. 37°C 인큐베이터에서 과산화효소를 20분 동안 차단합니다.
3. PBS로 슬라이드를 부드럽게 헹굽니다(3회 세척, 각 5분).
4. 37°C에서 5% 소 혈청 알부민(BSA 분말 1.5g과 RO 정제수 30mL를 혼합하여 제조된 BSA)으로 37°C에서 20분 동안 슬라이드를 차단합니다.
   참고: 3% 과산화수소로 차단하면 비특이적 염색의 95%를 방지할 수 있고 5% BSA로 차단하면 나머지 5%의 비특이적 염색을 방지할 수 있습니다. 두 가지 방법을 결합하여 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다.

4. 항원-항체 반응

1. 5% BSA를 제거하고 50μL의 1차 항체(칼레티닌, S100 또는 PGP9.5)를 슬라이드에 추가합니다. 4 °C에서 밤새 배양하십시오.
2. PBS로 슬라이드를 씻습니다(3회, 각 3분).
3. 50μL의 폴리머 인핸서(시약 A, 재료 표 참조)를 절편에 추가하고 37°C 인큐베이터에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS로 슬라이드를 씻습니다(3회, 각 3분).
4. 절편에 50μL의 2차 항체 B(염소 항토끼/마우스 IgG 2차 항체)를 추가하고 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다. PBS로 섹션을 씻습니다(3회, 각 5분).

5. 3,3-디아미노벤지딘 및 헤마톡실린 염색

1. 1.5mL 튜브에 850μL의 RO 정제수를 추가하고 염색 시약(재료 표 참조)을 A, B, C 순서로 추가합니다. 각 시약 50μL를 추가하여 총 1mL의 3,3-디아미노벤지딘(DAB) 작업 용액을 얻습니다. 침전물이 있는 경우 여과 후 용액을 사용하십시오.
2. 조직 섹션에 DAB 작업 용액 한 방울을 추가하고 3-10분 동안 염색합니다. 갈색 염색이 감지될 때까지 실온에서 DAB의 슬라이드를 배양합니다. 명시야 현미경을 사용하여 주의 깊게 모니터링하십시오. DAB 작업 솔루션을 빛에서 멀리 두십시오. 그런 다음 PBS로 슬라이드를 5분 동안 세척합니다.
3. 헤마톡실린 한 방울을 첨가하여 약 1분 동안 핵을 대조염색합니다. 그런 다음 코플린 항아리를 잡고 과도한 염료가 제거될 때까지 약 30-40초 동안 물방울로 씻습니다. 조직 부분이 손상되지 않도록 주의하십시오.
4. PBS가 들어 있는 코플린 병에 RSB 슬라이드를 25-30초 동안 담급니다. 그런 다음 10 초 동안 1 % 염산-에탄올을 구별합니다. PBS로 슬라이드를 1분 동안 씻습니다.
5. 수화의 역순으로 슬라이드를 탈수합니다: 75%, 80%, 95% 및 절대 에탄올(각 5분).
6. 슬라이드를 자일렌에 노출시킵니다(2회 변경, 각 5분).
7. 울트라클린 마운팅을 사용하여 커버슬립을 장착합니다. 현미경을 사용하여 시각화하기 전에 슬라이드를 건조시킵니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Calretinin 항체	MXB 바이오테크놀러지	MAB-0716 170416405C	항체: 1차 항체
S-100 항체	MXB 바이오테크놀러지	키트-0007	항체: 1차 항체
PGP9.5 항체	상하이 긴 섬 항체 Co. Ltd	R-0457-03	항체: 1차 항체
인핸서 시약	MXB 바이오테크놀러지	KIT-9902-A 170416405A	항체: secondary antibody A
Goat anti-Rabbit/Mouse IgG 2차 항체	MXB 바이오테크놀러지	키트-9902-B	항체: 2차 항체 B
DAB 염색 키트(시약 A, B 및 C 포함)	MXB 바이오테크놀러지	소량-0031	염색 키트
히트 인큐베이터	상하이 yiheng 악기 Co., Ltd	DHP-9082	악기
Rbi2 흡입 직장 생검 시스템	Aus Systems Pty Ltd, South Australia, 오스트레일리아	CP1200 HP1000 SS1000	악기
마이크로톰	라이카	라이카 RM2016	악기
구연산 나트륨 구연산염 완충액(100X)	MXB 바이오테크놀러지	MVS-0101	항원 회수 버퍼
병리학적 조직 탈수기	우한 junjie 전자 Co. 주식 회사	증권 시세 표시기-12층	악기

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