동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.
1. 해부액 및 인공뇌척수액의 제조
- 에어 스톤 버블 디퓨저(수족관용 통풍기)를 사용하여 5분 동안 탄수화물(95% O2/5% CO2)로 초순수(저항률 18.2MΩ·cm로 여과된 물)를 발화물합니다.
참고: 에어 스톤은 표준 실리콘 튜브를 통해 기화 탱크의 조절기 에 연결할 수 있습니다. 에어 스톤을 사용할 수 없는 경우 실리콘 튜브의 끝을 밀봉하고 밀봉에 작은 구멍을 뚫어 발탄 가스가 거품을 일으키고 용액을 발암시키도록 합니다.
- 표 1의 용질을 초순수에 용해시켜 해부 용액을 준비합니다. 최소 5분 동안 발암된 용액에 CaCl2을 첨가하여 용해되도록 합니다.
참고: 또는 CaCl2을 먼저 추가하여 불포화 용액에서 쉽게 용해될 수 있도록 합니다. 액체 형태의 용액은 300 - 320 mOsm/L이어야 하며 발암물질로 포화된 후 pH가 7.4여야 합니다.
- 해부 용액을 0 - 4 °C로 냉각합니다. 용액을 냉장고에 밤새 두거나 용액을 냉동실에 1시간 동안 넣고 온도를 지속적으로 모니터링하십시오.
참고: 해부 용액은 최대 3박 동안 보관할 수 있습니다. 나중에 폐기하십시오.
- 사용하기 전에 박리 용액을 5 - 10 분 동안 탄수화물화하십시오.
참고: 이상적으로는 용액이 슬러시로 나타나거나 사용 전에 슬러시로 전환되어야 합니다.
- 표 2의 용질을 초순수에 용해시켜 설치류 인공 뇌척수액(ACSF)을 준비합니다. ACSF 용액을 사용할 때까지 35°C로 가열된 수조에 있는 동안 발탄화합니다. 최소 5분 동안 발암된 용액에 CaCl2을 첨가하여 용해되도록 합니다.
참고: 또는 CaCl2을 먼저 추가하여 불포화 용액에서 쉽게 용해될 수 있습니다. 액체 형태의 용액은 290 - 320 mOsm/L이어야 하며 발암물질로 포화된 후 pH는 7.4여야 합니다. 용액은 실험 기간에 따라 1, 2 또는 4L 부피로 만들어야 합니다. 하루 종일(8시간) 실험을 위해 4L를 만드십시오. ACSF는 매일 새로 만들어야 합니다. 1일 이상 보관하지 마십시오.
2. 뇌 조직을 채취하기 위한 쥐 박리
- 동물 해부에 필요한 모든 도구와 재료를 수집하십시오. 동물 해부를 준비하기 위해 작업 공간을 설정합니다.
- 탄화 탱크(95%O2/5%CO2)가 비어 있지 않은지 확인하십시오. 남은 압력이 500psi 미만인 경우 실험 전에 가스 실린더를 교체하십시오.
위치 - vibratome(진동 블레이드 조직 슬라이서)을 제조업체의 사용 설명서에 따라 보정합니다. 절단 진폭을 1mm로, 절단 속도를 0.12mm/s로 조정하면 비브라톰 설정을 조정할 수 있습니다.
참고: 최적 설정은 개별 진동 티슈 블레이드 커터마다 다를 수 있습니다. 그러나 일반적으로 진폭은 높아야 하고 절삭 속도는 낮아야 합니다.
- 뇌 절편 배양실(, 즉 , 뇌 절편 보관기)을 ACSF로 채우고 발암원으로 거품을 냅니다. 그런 다음 배양 챔버를 35°C로 설정된 수조에 넣습니다.
- 13 d(p13)에서 21 d(p21, p0는 생년월일) 사이의 암수 중 하나의 어린 마우스를 얻습니다.
- 펜토바르비탈나트륨(체중 55mg/kg)의 복강내 주사로 마우스를 마취합니다. 마우스가 깊이 마취되면 발가락 핀치 반사가 없는 것으로 알 수 있듯이 즉시 수의사가 승인한 단두대 도구를 사용하여 한 번의 빠른 움직임으로 마우스의 목을 베십시오.
참고: 기관 지침에서 권장하는 절차에 따라 펜토바르비탈 나트륨 주사를 준비합니다.
- 마우스의 코를 잡고 목이 잘린 머리를 안정시키고 마우스의 눈 사이부터 두피 전체를 따라 정중선을 부드럽게 절개하여 두개골을 드러냅니다. 두개골이 면도기에 가해지는 압력에 의해 압축되지 않았는지 확인하십시오. 면도기 가장자리 모서리를 사용하여 절단 정밀도를 높입니다.
- 두개골을 드러내기 위해 손가락을 사용하여 마우스의 두피 덮개를 벌립니다. 그런 다음 면도기 가장자리의 새 모서리를 사용하여 두개골의 정중선을 따라 절개합니다. 대뇌 피질과의 접촉을 피하기 위해 주의를 기울이십시오.
- 쥐의 안와에 파편 집게를 삽입하여 목이 잘린 머리를 안정시키고 차가운(0 - 4 °C) 해부 용액을 채운 페트리 접시에 넣습니다. 머리가 해부 용액에 완전히 잠겼는지 확인하십시오.
- 두 번째 파편 집게 세트를 사용하여 마우스의 두피를 부드럽게 벗겨내고, 코뼈를 벗겨 뼈를 제거하고, 두개골의 뒤쪽(꼬리 쪽)을 제거합니다.
참고: 어린 쥐의 코뼈는 매우 부드럽고 쉽게 부러집니다.
- 마이크로 주걱을 사용하여 시신경, 삼차 신경 및 척수를 절단합니다. 그런 다음 마이크로 주걱을 사용하여 뇌와 두개골을 부드럽게 분리한다. 뇌를 해부 용액으로 채워진 페트리 접시에 완전히 담그십시오.
3. 체성 감각 운동 피질의 피질 절편 준비
- 비브라톰의 버퍼 트레이에 ~150mL의 차가운(0 - 4°C) 해부 용액을 채웁니다.
참고: 선택적으로, 슬라이스 절차 중에 낮은 온도를 유지하기 위해 필요할 때까지 버퍼 트레이를 냉동실에 보관하십시오.
- 순간 접착 접착제를 사용하여 마우스의 뇌 조직을 vibratome s에 붙입니다.tage(표본 홀더/트레이). 생쥐의 경우, 뇌의 작은 꼬리 부분(, 즉 , 소뇌)을 잘라서 표본 홀더에 쉽게 평평하게 붙일 수 있도록 합니다(뇌의 꼬리 쪽이 천장을 향하도록 허용).
참고: 대안으로, 뇌의 등쪽을 표본 홀더에 붙여서 수평 마우스 뇌 절편을 준비할 수 있습니다(뇌의 복부 쪽은 천장을 향해야 함).
- 표본 홀더(뇌 조직 포함)를 버퍼 트레이에 부드럽게 놓습니다. 뇌의 등쪽 부분이 비브라톰의 칼날을 향하고 있는지 확인합니다.
참고: 뇌가 공기에 노출되는 시간을 최소화하는 것이 중요합니다.
4. 뇌 조직 절편 및 수집
- 뇌를 등쪽에서 복부 방향으로 진동을 사용하여 뇌를 450μm 두께로 자릅니다. 뇌를 자르는 동안 표본 트레이에 완전히 고정된 상태로 유지되는지 확인합니다.
- 후각구를 제거하기 위해 쥐의 뇌를 먼저 절개합니다. 그런 다음 체성 감각 운동 영역이 관찰될 때까지 후속 절단을 합니다(후각구와 브레그마 사이의 대략 중간에 위치).
참고: 선택적으로, 뇌의 관상동맥 시야에 체감각 운동 영역이 가깝다는 것을 나타내는 말뭉치가 나타날 때까지 뇌를 더 얇게(200μm) 얇게 자릅니다.
- 광경 전사 피펫을 사용하여 체성 감각 운동 영역이 포함된 관상 동맥 절편(450 μm)을 수집하고 차갑은(0 - 4 °C) 해부 용액이 들어 있는 페트리 접시에 담급니다.
- 새 면도날을 사용하여 조각에서 여분의 조직을 잘라냅니다. 생쥐의 관상 절편의 경우, 신피질 커미셔리(i.e., corpus callosum) 바로 아래에서 횡방향 절단을 수행합니다. 톱질하는 동작으로 절단하지 마십시오. 칼날에 압력을 가하여 조직에 압력을 가하고 디테일링 브러시를 사용하여 조직을 부드럽게 분리하기만 하면 됩니다. 관상 절편의 움직임을 최소화해야 합니다.
- 광역 전사 피펫을 사용하여 신피질(레이어 1 - 6)을 포함하는 관상 절편의 등쪽 부분을 잠시(~1초) 동안 따뜻한(35°C) ACSF로 채워진 두 번째 페트리 접시로 옮깁니다. 그런 다음 즉시 슬라이스를 따뜻한(35°C) 발암된 ACSF가 포함된 배양 챔버로 옮깁니다.
참고: ACSF를 사용하여 페트리 접시로 옮기는 목적은 배양실로의 박리 용액 이동을 최소화하는 동시에 광경 피펫으로 뇌 절편을 옮기는 것입니다. 인큐베이션 챔버의 여러 웰을 활용하여 다양한 뇌 조각을 정리하세요.
- 나머지 뇌와 동물 사체는 기관 지침에 따라 폐기합니다.
5. 배양 및 유지
- 뇌 절편을 35°C의 배양실에 30분 동안 약간 담근다. 그런 다음 수조에서 배양 챔버를 제거하고 실온(20 - 25 °C)으로 되돌립니다. 전기생리학적 기록을 수행하기 전에 뇌 절편이 회복될 때까지 1시간 동안 기다립니다.
참고: 배양실의 뇌 절편 아래에 기포가 쌓이지 않도록 하세요. 기포는 조직 손상을 일으키는 공기 경계면입니다. 생쥐의 뇌 절편은 ACSF가 있는 발암이 잘 된 배양 챔버에서 6 - 8시간 동안 유지될 수 있습니다.
6. 표재성 피질층의 전기생리학적 기록
참고: 익탈 사건은 뇌 절편의 세포외 국소장 전위(LFP) 기록에서 관찰됩니다. 뇌 절편의 LFP는 인터페이스 유형 챔버 또는 수중 다중 전극 어레이(MEA) 시스템으로 관찰하고 기록할 수 있습니다.
- 광경 전사 피펫 또는 디테일링 브러시를 사용하여 치과용 핀셋을 사용하여 제자리에 고정한 약간 더 큰 미리 절단된 렌즈 종이로 뇌 절편을 이동합니다. 렌즈 종이(뇌 조각이 놓여 있는)를 녹음실로 옮기고 하프 스크린으로 제자리에 고정합니다.
- 온난하게(35°C) 발암화된 ACSF는 3mL/분(~1drip/s)의 속도로 기록 챔버를 통해 뇌 절편을 통해 관류합니다. 디지털 온도계를 사용하여 기록 챔버가 33 - 36°C인지 확인하십시오.
- 풀러를 사용하여 붕규산 유리관(외경 1.5mm)에서 임피던스가 1 - 3MΩ인 유리 전극을 당깁니다. Hamilton 주사기를 사용하여 유리 전극을 ACSF(~10μL)로 다시 채웁니다. 팁이 손상된 경우 전극을 즉시 폐기하십시오.
참고: 은선을 표백제(5분)하고 은선의 최소한의 부분(즉, , 팁)만 ACSF 역충전 유리 전극에 담가두어 녹음 중 소음과 드리프트를 최소화합니다. 필요한 경우 Hamilton 주사기를 사용하여 유리 전극에서 과도한 ACSF를 제거합니다.
- 20X 실체 현미경을 사용하여 수동 조작기를 사용하여 기록 유리 전극을 표재성 피질층(2/3)으로 정확하게 안내합니다. 기록/view 표준 소프트웨어가 있는 컴퓨터에서 뇌 절편의 전기 활동을 확인하십시오.
참고: 실행 가능한(고품질) 뇌 절편은 광유전 조직에 가해진 전기 자극(100 μs, 30 - 300 μA) 또는 광 펄스(30 ms, 10 mW/mm2)에 대한 반응으로 강력한 유발 전위를 나타냅니다.
7. 발작과 유사한 활동의 유도
- 100μM 4-아미노피리미딘(4-AP)을 함유한 ACSF를 뇌 절편에 관류합니다. 8.5mL의 물에 80mg의 4-AP를 용해시켜 100mM 4-AP의 원액을 만듭니다. 100μL의 100mM 4-AP 원액을 100mL의 ACSF에 첨가하여 100μM 4-AP의 ACSF 관류물을 얻습니다.
참고: 또는 Mg2+가 첨가되지 않은 수정된 ACSF 용액인 Zero-Mg2+ ACSF ( 표 3)를 사용하여 뇌 절편을 관류합니다. ictal 이벤트가 나타나는 평균 시간은 15분입니다. 그러나 일부 뇌 절편의 경우 최대 40분이 소요될 수 있습니다.
8. 주문형 발작 생성: 광유전 마우스에 대한 광유전학 전략
- 청색(470nm) 광의 짧은(30ms) 펄스(최소 1mW/mm2 출력 강도)를 적용하여 ictal 이벤트를 시작합니다. 수동 매니퓰레이터를 사용하여 1,000μm 코어 직경 광섬유(0.39NA)를 기록 영역 바로 위에 배치합니다.
참고: 원하는 ictal 이벤트 발생 속도(, 즉, , 50초마다 1펄스)와 일치하도록 광 자극 속도를 설정합니다. 그러나 그 비율은 ictal 사건이 발생하는 내재 비율에서 지나치게 과장될 수 없습니다.
표 1: 해부 용액을 위한 레시피. 1L 또는 2L 볼륨을 만들기 위한 지침입니다. MW = 용질의 분자량.
| # | 시약 | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 1L (g) | 2L (g) |
| 1 | 설탕 | 248 | 342.3 | 84.89 | 169.78 |
| 2 | 중탄산나트륨 (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 2.18 | 4.37 |
| 3 | 포도당 (D-포도당) | 10 | 180.16 | 1.8 | 3.6 |
| 4 | 염화칼륨 (KCl) | 2 | 74.55 | 0.15 | 0.3 |
| 5 | 황산마그네슘 (MgSO4·7H2O) | 3 | 246.47 | 0.74 | 1.48 |
| 6 | 인산나트륨 일염기성 일수화물 (H2NaPO4·H2O) | 1.25 | 137.99 | 0.17 | 0.34 |
| 7 | 염화칼슘 (CaCl2·2H2O) | 1 | 147.01 | 0.15 | 0.29 |
표 2: 설치류 인공 뇌척수액(ACSF) 제조법. 2L 또는 4L 볼륨을 만들기 위한 지침입니다. MW = 용질의 분자량.
| # | 시약 | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | 염화나트륨 (NaCl) | 123 | 58.4 | 14.37 | 28.73 |
| 2 | 중탄산나트륨 (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | 포도당 (D-포도당) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | 염화칼륨 (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | 황산마그네슘 (MgSO4·H2O) | 1.3 | 246.47 | 0.64 | 1.28 |
| 6 | 인산나트륨 일염기성 일수화물 (HNaPO4·H2O) | 1.2 | 137.99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | 염화칼슘 (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0.44 | 0.88 |
표 3: Zero-Mg2+ 설치류 인공 뇌척수액(Zero-Mg2+ ACSF) 레시피. 2L 또는 4L 볼륨을 만들기 위한 지침입니다. MW = 용질의 분자량.
| # | 시약 | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | 염화나트륨 (NaCl) | 123 | 58.4 | 14.37 | 28.73 |
| 2 | 중탄산나트륨 (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | 포도당 (D-포도당) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | 염화칼륨 (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | 황산마그네슘 (MgSO4·H2O) | 명목상 무료 | 246.47 | 0 | 0 |
| 6 | 인산나트륨 일염기성 일수화물 (HNaPO4·H2O) | 1.2 | 137.99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | 염화칼슘 (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0.29 | 0.59 |