마우스에서 펜틸레네테트라졸 유발 간질 발작 모델 확립

초록

출처: Shimada, T., et al. Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 GABA-A 수용체 길항제인 펜틸렌테트라졸(PTZ) 주사를 사용하여 마우스에서 간질을 유발하는 과정을 보여줍니다. PTZ의 반복적인 복강 내 투여는 염화물 이온 유입을 억제하고 억제성 신경 전달을 방해하며 발작을 유발하는 뉴런의 과흥분성을 유발하여 발작 역치를 점진적으로 낮춥니다. 이 과정은 불을 붙이고 자연 발작을 일으켜 만성 간질을 모방합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 펜틸레네테트라졸 (PTZ)

제조

1. 2mg/mL PTZ를 멸균 0.9%(w/v) NaCl에 용해시킵니다. 사용 당일에 PTZ를 준비하십시오.

2. PTZ 주입

1. 오전 9:00에서 오후 12:00(정오) 사이에 모든 실험을 수행합니다.
2. 동물의 체중을 측정합니다.
3. 동물이 습관화될 수 있도록 관찰실에 놓습니다.
4. 습관화 기간(3분) 동안 동물의 체중과 미리 결정된 주사 용량을 기준으로 주사를 위한 PTZ 용액의 부피를 계산합니다.
   참고: 예를 들어, 35mg/kg PTZ를 사용하는 경우 25g(35mg/kg x 0.025kg = 0.875mg) 마우스에 0.875mg의 PTZ가 필요합니다. 따라서 2mg/mL PTZ 용액 437.5μL를 주입해야 합니다(0.875mg / 2mg/mL = 0.4375mL). PTZ의 주입량은 마우스의 유전자형과 균주에 따라 다릅니다. 야생형 C57BL/6 마우스의 경우, 첫 번째 시험에서 체중 30-35mg PTZ/kg의 용량을 권장한다. PTZ에 대한 민감도는 사용된 마우스 변형에 따라 다릅니다. 주사 용량은 실험의 목적에 따라 다릅니다.
5. 27게이지 바늘에 부착된 1mL 주사기를 사용하여 PTZ를 복강내 주사하는 동물의 복부 왼쪽 또는 오른쪽 사분면에 주입합니다. 정중선에 주입하지 마십시오.
   1. 같은 위치에서 반복 주입하지 마십시오.
6. PTZ 투여 후 30분 동안 동물의 행동을 관찰하고(그림 1A) 아래와 같이 비정상적인 행동을 분류하고 점수를 매깁니다. 가능하면 24시간 동안 또는 주사 후 최소 6-10시간 동안 동물을 관찰해야 하며, 특히 발작 심각도 점수가 3 이상에 도달하면 더욱 그렇습니다.
   1. 30분의 관찰 기간 이후 동물에서 가벼운 발작이나 행동 변화가 있는지 확인하십시오. 이 장기간의 관찰 기간은 간질에서 만성 이유 없는 발작의 발생에서 PTZ의 경련하 용량의 특히 중요하고 완전한 효과를 해결할 수 있습니다.
   2. 또한, 발작 기간의 변화가 발작 중증도와 관련되어 있으므로 관찰된 각 발작의 발작 지속 시간을 측정합니다. 또한, PTZ 주입 후 첫 번째 발작까지의 대기 시간은 수집해야 할 또 다른 중요한 척도입니다. 발작 빈도, 지속 시간 및 잠복기를 모니터링하는 것은 모든 발작 후 분자 연구에 매우 중요합니다.
7. 격일로 PTZ를 주입합니다(그림 1A). 주입 횟수는 실험의 목적에 따라 다릅니다. 대표적인 예는 다음과 같습니다.
   1. 완전히 불이 붙은 동물을 생성하려면, 동물이 5점(강장제-간대성 발작)의 발작을 경험하면 추가로 3회 투여 내에 주사를 마칩니다. 이 경우 3회 연속 투여해도 발작 점수가 증가하지 않으면 주사 용량을 늘립니다. 각 동물은 다른 수의 PTZ 주사를 맞을 수 있습니다.
   2. 항간질 약물 평가 및 유전자 변형 마우스의 표현형 연구를 포함하여 PTZ에 대한 취약성을 평가하기 위해 모든 조건에서 PTZ 주사의 횟수와 용량을 수정합니다. 모든 동물에게 동일한 횟수의 PTZ 주사를 제공합니다. 총 8-12회 주사를 권장합니다. 동물이 죽었을 경우, 발작 점수는 6으로 표시되어야 한다.
   3. 간질 발작이 발생하는 조직병리학적 변화를 연구하기 위해 10회 이상 주사에 대해 높은 발작 점수(4 또는 5)를 유지하는 데 필요한 주사 용량을 결정합니다. 이 경우 총 주입 횟수는 25에서 30 사이여야 합니다. 발작 점수가 5에 도달하면 주사 용량을 줄입니다. 발작 점수가 3 이하로 떨어지면 주사 용량을 늘립니다.

결과

그림 1: 프로토콜에 대한 간략한 설명. (A) PTZ 매개 킨들링의 개략도. (나) 각 발작 점수에 대한 대표적인 동물 행동의 그림.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
펜틸레네테트라졸	시그마-알드리치	P6500
염화나트륨	마낙	7647-14-5
마우스	CLEA 일본		C57Bl/6NJcl, 출생 후 8주, 수컷
주사기 (1mL)	테루모	친위대-01T
바늘(27G x 3/4") (0.40 x 19mm)	테루모	NN-2719S
저울	메틀러	PE2000	이 제품은 단종된 제품입니다. A&D 회사의 FXi-12-JA가 있는 FX-2000i와 거의 동일합니다.