쥐 모델에서 중추 및 일반 경동맥 폐색을 통한 허혈 유도

초록

출처: Wayman, C. et al., Performing Permanent distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability. J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 허혈성 뇌졸중을 모델링하기 위해 노화된 쥐에서 총경동맥 또는 CCA 결찰술을 사용하여 영구 원위 중대뇌동맥 폐색(MCAO)을 수행하는 절차를 보여줍니다. 이는 뇌로 가는 혈류를 차단하여 신경 세포의 사멸로 이어지며 뇌졸중 메커니즘과 잠재적 치료법을 연구하기 위한 모델을 생성합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 수술

1. 16-18개월(250-400g)에 암컷 늙은 Lister-Hooded 쥐를 사용하고 1.5L/min O₂에 5% 이소플루란으로 마취를 유도합니다. 마취 유도 후 이소플루란 수치를 낮추고 수술을 위해 적절하지만 최소화된 깊이로 유지합니다(예: , 1.5-2%). 안면 마스크로 동물에게 마취를 전달하고 청소 시스템을 사용하여 외과의가 이소플루란에 노출되는 것을 제한합니다.
   1. 가짜 동물에 대한 개두술을 포함하되 이 절차는 행동 결함을 유발할 수 있으므로 개두술을 포함하지 않는 모든 절차를 수행하십시오. 중대뇌동맥폐색(MCAO) 실험을 설계할 때 실험 목표를 고려하고, 개두술을 위해 대조군을 가설화해야 하는지 여부를 결정해야 합니다.
2. 수술 전 또는 수술 전후에 통증 완화를 투여합니다(Carprieve, 0.25 mg/kg, s. cut).
   1. 19ml에 1ml의 멸균 0.9% 식염수를 첨가하여 원액을 만들고 쥐 300g당 0.6ml를 주입합니다. Carprieve의 사용은 Carprofen보다 선호되는데, 그 이유는 Carprofen이 실온(RT)에서 안정적이기 때문입니다.
3. 복부 목 부위와 오른쪽 반구의 측두 부위의 털을 면도하여 피부를 노출시킵니다. 에탄올 면봉을 사용하여 수술 부위를 소독합니다.
   1. 절개 부위의 털 양을 최소화하기 위해 수술 부위에서 떨어진 곳에서 이 단계를 수행합니다.
4. 멸균 드레이프로 덮인 코르크 판에 쥐를 놓고 가열 패드의 누운 자세로 놓습니다. 리도카인 크림을 머리와 목의 면도 부위에 바릅니다. 직장 프로브를 삽입하여 항온 시스템으로 동물의 온도를 36.5-37.5 ° C 사이로 모니터링하고 유지하십시오.
   1. 건조를 방지하기 위해 눈물 윤활 연고를 눈에 바르십시오. 기관 분비물을 줄이기 위해 랫트에게 아트로핀 황산염 용액(600μg/ml 용액 0.05ml)을 주사합니다.
      참고: 연구자들은 혈액 가스 및 압력과 같은 생리학적 변수를 측정하는 것을 고려해야 합니다.
5. 수술을 시작하기 전에 뒷발 핀치 금단 및 깜박임 반사 신경을 확인하여 완전한 마취를 확인하십시오.
6. 해부 현미경으로 메스를 사용하여 노출된 목을 2cm 중앙 정중선 절개합니다. 침샘을 양쪽 기관 옆으로 부드럽게 움직입니다.
7. 한쪽의 총경동맥 위에 있는 피부 주위에 흡수되지 않는 실크 봉합사를 감습니다. 실크 봉합사를 사용하여 해당 부위의 피부를 부드럽게 당겨내고 수술 테이프를 사용하여 코르크 보드에 붙여서 총경동맥을 드러냅니다. 가느다란 집게를 사용하여 동맥을 주위의 근막과 미주신경이 없는 동맥을 조심스럽게 무딘 절개합니다.
   1. 이 단계에서 근육이나 미주 신경이 손상되지 않도록 주의하면 수유, 삼키기 및 호흡에 문제가 생길 수 있습니다.
8. 총경동맥이 노출되면 비흡수성 실크 봉합사(5/0)를 사용하여 경동맥을 분리하고, 먼저 미세한 집게로 역절부하여 경동맥과 미주신경을 분리하고 신경에 닿지 않도록 주의합니다. 혈관이 봉합사로 고리를 이루면(묶이지 않음) 이 단계가 취소되는 것을 방지하기 위해 수술 테이프를 사용하여 봉합사 끝을 함께 테이프로 붙입니다. 그 위에 있는 피부를 잡고 있는 봉합사를 제거합니다.
9. 반대쪽도 반복합니다.
10. 식염수에 적신 멸균 거즈를 상처에 대고 남은 수술 기간 동안 조직을 촉촉하게 유지합니다. 피부를 느슨하게 봉합하고 식염수에 적신 거즈를 해당 부위에 추가로 씌워 추가 탈수를 방지합니다.
11. 쥐를 옆으로 눕히고 오른쪽 안와와 외이도 사이의 중간 지점에서 피부를 절개합니다. 코르크 판에 고정된 최대 5개의 탄성 3mm 후크 견인기를 사용하여 피부를 집어넣은 다음 측두근을 둔하게 절개하여 두개골을 드러냅니다.
12. 썸 휠로 조절된 중력 구동 식염수 점적액을 개방된 부위(유속 약 2ml/분) 위에 놓고 흡인기 시스템을 설치하여 뼈 파편을 제거하고 수술의 이 단계 전반에 걸쳐 노출된 부위에서 경미한 출혈을 제거합니다.
    1. 식염수 전달 노즐을 귀 근처 두개골의 가장 높은 지점에 놓고 흡입기 노즐을 가장 낮은 지점에 놓습니다. 출혈 중 휠을 조정하여 해당 부위에 더 많은 식염수를 공급하여 혈관 소작을 위한 출혈의 원인을 더 잘 시각화하여 동물이 마취되는 시간을 줄입니다.
13. 약 8,000rpm에서 거친 1.6mm 다이아몬드 코팅 드릴 버가 있는 치과용 드릴을 사용하여 노출된 영역(약 5mm x 5mm)에 개두술을 수행하여 노출된 영역을 드릴링하는 동안 하향 압력이 아닌 원형 및 측면 압력이 가해지도록 합니다. 뼈가 완전히 투명해 보일 정도로 얇아지면 집게를 사용하여 제거합니다.
14. 가는 집게의 한쪽 끝을 약 180° 구부려 호를 형성하여 만든 수제 경막 고리를 사용하여 경막을 조심스럽게 열고 연약하고 파열되기 쉬운 큰 표면 혈관을 피하도록 주의하십시오.
    위치 참고: 뇌의 노출된 영역은 중대뇌동맥(MCA)을 드러냅니다. 원하는 세그먼트의 길이는 약 2mm입니다(그림 참조).
15. 하대뇌 정맥이 교차하는 곳에서 동맥 분기점까지 MCA를 응고한 다음 완전히 막힐 때까지 한 쌍의 투열 요법 겸자를 사용하여 MCA의 꼬리 가지를 따라 응고합니다. 끝이 0.25mm인 각진 Jeweler 투열 요법 집게를 사용하십시오.
    1. 동맥을 막을 때는 필요에 따라 식염수 흐름을 변경하여 이 부위를 시원하게 유지하여 응고하는 겸자가 혈관에 부착되는 것을 방지합니다. 막히면 혈관이 검게 보이며 혈류의 징후가 없어야 합니다. 부분적으로 막힌 혈관에서 혈류를 볼 수 있습니다.
    2. 이 시점에서 MCA를 잘라 완전한 폐색을 확인합니다. 미세혈관 가위를 사용하여 하대뇌 정맥이 MCA를 가로지르는 곳 아래를 자릅니다.
    3. 다음 단계를 계속하기 전에 식염수에 적신 거즈 패드로 노출된 부위를 덮습니다.
16. 쥐를 다시 누운 자세로 돌리고 느슨하게 묶인 목의 봉합사를 다시 열어 경동맥을 다시 노출시킵니다. 경동맥 주위의 실크 봉합사에 매듭을 묶어 폐색된 MCA(오른쪽)와 같은 쪽의 경동맥을 영구적으로 결찰하고, 왼쪽 경동맥은 125g 압력의 13mm 스테인리스 스틸 동맥 클립을 사용하여 60분 동안 일시적으로 폐색합니다. 이 기간 동안 절개 부위를 느슨하게 봉합하고 그 위에 멸균 식염수를 적신 거즈를 올려 탈수를 방지합니다.
    1. 동물의 오른쪽은 앙와위 위치를 감안할 때 외과 의사의 왼쪽에 있습니다.

결과

그림 1. 영구 원위 중대뇌 동맥 폐색 모델의 외과적 설정. 쥐 개두술을 위한 설정에 사용된 장비는 우반구에 대해 표시되며, 삽입, 흡인기의 위치 및 두개골 절제술 부위 주변의 식염수 물방울이 표시됩니다. 또한 혈관 구조의 주요 특징이 표시됩니다. 중대뇌동맥(빨간색)과 하대뇌정맥(파란색)이 표시되며, 음영 처리된 영역은 동맥의 응고가 발생하는 위치를 나타냅니다. 폐색의 확인은 하대뇌정맥 아래의 MCA를 절단하여 수행됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
카르프로펜	노브룩	VM 번호; 02000/4229	0.25mg/kg
아트로핀 황산염	암테크	크시트린-100
알코올 면봉	UHS	20021년
리도카인 크림 (Emla)	아스트라제네카	12901	면도한 목과 측두부에 완두콩 크기의 한 방울을 바르십시오
동종세포 담요 시스템	하버드 인스트루먼트	507222F
겸자	정밀 과학 도구	11019-12
이소플루란	애보트	B506
실크 봉합사	하버드 장치	723288
소추계	에슈만
0.25mm 보석상 코터리 집게	에슈만	8330349
고급 듀몽 집게	정밀 과학 도구	11251-10
엄지 손가락으로 구동되는 식염수 드립 시스템
Vacusafe 흡인기 시스템	인테그라 바이오사이언스	158320
16mm 거친 다이아몬드 코팅 스틸 버		K801 104 016
휴대용 치과 드릴	NSK	NSKVMAXVRE (핸드피스 NSKEX6B)
Vannas 봄 가위	정밀 과학 도구	15000-03
미세혈관 가위	세계 정밀 기기	501790
4-0 빅릴 봉합사	에티콘
혈관 클립 및 어플리케이터
작동 현미경	자이스
소형 마취 시스템 이소플루란 K/F 단일 가스	VetTech 솔루션
탄소강 메스 블레이드 No. 10	스완모턴	201
25g	테루모	NN-2525R
주사기(1ml 및 5ml)	테루모	SS+01T1 / SS*05SE1
식염수(염화나트륨 0.9%)	프레지니우스 카비	pl 08828/0178
면봉	존슨앤드존슨	5.00021E+12	사용 전 소독
거즈			사용 전 소독

제공 바늘