쥐 척수 뉴런의 탈수초화(Demyelination and Remyelination of Mouse Spinal Cord Neurons)

초록

출처: Keough, M. B., et al. Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin. J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오는 리솔레시틴 주사를 사용하여 마우스 척수 뉴런에서 탈수초화를 유도한 후 희소돌기아교세포 전구세포의 이동 및 분화를 통해 재수초화를 유도하는 방법을 보여줍니다. 이 과정은 신경 세포 신호 전달을 손상시킨 다음 점차적으로 복원합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 주사기를 주사할 준비

1. 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)에 1% 용액에 리솔레시틴을 용해시키고 -20°C에서 작은 분취량(75μl)에 보관합니다. 바이알을 실온(RT)으로 해동합니다.
   참고: 리솔레시틴이 용해되지 않은 경우 초음파 세척기(40kHz)에서 튜브를 약 30분 동안 초음파 처리하여 균일한 용액을 형성합니다.
2. 섬세한 팁이 손상되지 않도록 미리 당겨진 유리 모세관을 각별히 주의하여 다루십시오. 10μl 주입 주사기의 너트를 풀고 모세관의 평평한 끝 부분에 끼운 다음 두 개의 페룰을 끼우고 페룰의 결합 끝이 정렬되고 모세관이 원뿔형 페룰에 꼭 맞는지 확인합니다(그림 1). 이소프로필 알코올로 주사기를 헹구고 플런저를 제거합니다. 건조되면 바늘 어셈블리를 주입 주사기에 손으로 단단히 조입니다.
3. 금속 허브 바늘을 프라이밍 주사기에 부착합니다. 바늘로 고무 디스크를 뚫고 바닥으로 밀어 넣습니다. 프라이밍 주사기에 리솔레시틴을 채웁니다. 바늘 끝에 액체가 보일 때까지 프라이밍 주사기를 부드럽게 누릅니다. 이렇게 하면 주사기에 기포가 유입되지 않습니다.
4. 프라이밍 주사기의 금속 허브 바늘을 주입 주사기에 삽입합니다. 고무 디스크로 단단히 밀봉하고 모세관이 팁에 용액을 채울 때까지 프라이밍 주사기를 천천히 누릅니다. 프라이밍 주사기를 조심스럽게 제거하는 동시에 기포가 발생하지 않도록 주입 주사기의 배럴을 채우기 위해 누릅니다. 플런저를 주입 주사기에 삽입하고 플런저를 부드럽게 누를 때 모세관 끝에서 용액이 흐르도록 합니다.
   참고: 모세관 또는 주입 주사기에 기포가 보이면 주사기 준비를 처음부터 반복해야 합니다. 주입 장치의 연속 유체는 정확한 주입량을 보장하는 데 중요합니다.
5. 완성된 주입 주사기를 정위 마이크로 매니퓰레이터의 암에 부착합니다. 이 완성 된 장치는 재 충전이 필요하기 전에 15-20 마리의 동물을 주입 할 수 있습니다.
6. 프라이밍 주사기에서 남은 리솔레시틴을 버립니다. 이소프로필 알코올을 여러 번 빼고 누르고 금속 허브 바늘을 분리합니다. 프라이밍 주사기에 남아 있는 이소프로필 알코올이 증발할 때까지 몇 시간 동안 기다렸다가 다시 주입하십시오.

2. 외과 수술을 위한 동물 준비

참고: 이 절차는 8-10주 된 암컷 C57BL/6 마우스에 대해 설명되어 있습니다.

1. 케타민(200mg/kg) 및 자일라진(10mg/kg)의 복강 내 주사로 동물을 마취하거나 기관 동물 관리 규정에 따라 동물을 마취합니다. 주사 마취를 사용하는 경우 동물이 약 1시간 동안 마취 상태를 유지하도록 계획하십시오.
2. 동물이 발을 단단히 꼬집어 깊이 마취되었는지 테스트합니다. 적절하게 마취된 동물은 핀치에 반응하지 않습니다.
3. 가위를 사용하여 동물의 등 쪽에서 귀에 가까운 2-3cm² 영역을 면도합니다. 귀가 손상되지 않도록 주의하세요.
4. 거즈 패드에 70% 에탄올을 바르고 해당 부위를 깨끗이 닦습니다. 해당 지역에서 잘린 머리카락이 모두 제거되었는지 확인하십시오. 해당 부위를 요오드로 소독하십시오.
5. 시술 내내 건조를 방지하기 위해 바셀린을 눈에 바르십시오.
6. 절차를 시작할 준비가 될 때까지 동물을 가열된 회수실에 보관하십시오.

3. 수술 수행

참고: 절차의 모든 단계에 대해 적절한 무균 기술을 확인하십시오. 여기에는 장갑, 헤어네트, 마스크 및 커튼의 올바른 사용이 포함됩니다. 모든 도구는 동물과 접촉하기 전에 살균해야 합니다.

1. 척추의 곡률을 과장하기 위해 접힌 종이 타월로 중간 부분을 들어 올리고 등쪽이 위로 향하게 하여 동물을 정위 프레임으로 이동합니다. 수술용 테이프로 팔과 꼬리를 고정하고 치아 클램프로 머리를 고정합니다. 이 절차에는 이어바를 안정화할 필요가 없습니다.
2. 메스를 사용하여 귀 바로 아래에서 시작하여 꼬리 방향으로 3cm 정중선을 절개합니다.
3. 두 개의 큰 지방 구조 사이의 분할을 찾고 각 손에 가는 집게를 사용하여 분리하십시오. 견인기를 펼쳐 수술 영역을 엽니다. 위치
4. 외과용 현미경으로 흉추 2(T2) 척추의 두드러진 성장 과정을 찾습니다(참고: 이 특징은 C57BL/6 마우스 균주의 특징입니다). T2를 더 잘 시각화하기 위해 겹쳐진 근육 조직을 통해 닫힌 스프링 가위로 무딘 해부를 수행합니다. 겸자를 사용하여 흉추 3(T3)과 흉추 4(T4)의 단단한 표면을 만져 적절한 해부학적 위치를 확인합니다.
5. 스프링 가위를 사용하여 T3와 T4 사이의 결합 조직을 얕은 측면 절단(2-3mm 깊이)합니다. 쥐의 척추 기둥의 상부 흉추 부분에 있는 척추 사이의 자연스러운 간격으로 인해, 척수를 드러내기 위해 후판 절제술이 필요하지 않습니다. 너무 깊게 자르면 코드가 관통되어 손상될 수 있습니다.
   참고: 이 단계에서 약간의 출혈이 흔합니다. 이 경우 출혈이 가라앉을 때까지(30-60초) 스펀지 창을 해당 부위에 대십시오.
6. 척수를 시각화합니다. 탯줄을 노출시키는 동안 이 수막층이 아직 절단되지 않은 경우 눈에 보이는 경막의 두꺼운 층으로 덮일 것입니다. 두드러진 혈관은 척수의 대략적인 정중선을 통해 꼬리/주를 뻗어 있습니다.
   참고: 이 혈관 구조는 정중선의 랜드마크로 사용되어서는 안 됩니다. 대신, 적절한 조명은 등쪽 기둥 옆의 회백질 경계를 드러내야 하며, 이는 정중선을 추정하는 데 사용되어야 합니다.
7. 경막이 손상되지 않은 경우 32G 금속 바늘로 투명해질 때까지 옆으로 부드럽게 긁어냅니다. 목표는 경막을 제거하면서 두껍지 않고 보기 어려운 남아 있는 수막을 절단하지 않는 것입니다.
   참고: 뇌척수액의 방출은 지주막의 파열을 의미하며, 이는 조직의 기계적 손상 없이 발생할 수 있지만 축적된 뇌척수액은 탯줄 표면을 더 잘 보이도록 스펀지 창으로 제거해야 합니다.
8. 주사기를 제자리로 옮기고 모세혈관 끝이 정중선 양쪽 바로 옆의 척수에 거의 닿지 않을 때까지 천천히 내립니다. 암을 제자리에 잠급니다.
9. Z 방향 정위 암의 등급별 측정을 사용하여 기준선 위치 측정을 수행합니다. 이 판독값에서 1.3mm를 뺍니다. 빠르고 얕은 아래쪽 동작을 사용하여 조직을 뚫고 새로운 측정에 도달할 때까지 모세혈관을 조심스럽게 내립니다. 선택 사항: 원하는 경우 등쪽 기둥의 병변은 정중선에서 동일한 피어싱 동작과 0.3mm 깊이로 생성될 수 있습니다.
   참고: 이 값은 T3와 T4 사이에 주입하는 데 사용됩니다. 척수의 다른 위치에서 주사를 수행하기로 선택한 경우 이러한 값은 사용 가능한 모든 마우스 뇌 지도에서 파생되어야 합니다.
10. 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 리솔레시틴을 복부 척수 백질로 밀어 넣습니다. 마이크로매니퓰레이터를 5초마다 2분 동안 한 번 회전하면 최종 부피가 0.5μl가 됩니다. 용액의 역류를 방지하기 위해 모세관을 2분 더 제자리에 두었다가 조심스럽게 모세관을 제거합니다.
11. 척추를 덮고 있는 근육/지방 조직에 단일 봉합사를 묶습니다. 중단 없는 봉합사를 사용하여 피부를 봉합합니다. 절개 부위에 요오드를 더 많이 바릅니다.
12. 동물이 회복될 때까지 가열된 회수실에 동물을 눕힌 다음 우리로 되돌려 놓습니다. 기관의 동물 관리 규정에 따라 수술 후 진통제를 바르십시오. 동물은 완전히 보행할 수 있고 마취에서 회복되자마자 스스로 먹이를 먹고 마실 수 있기 때문에 일반적으로 추가 수술 후 관리가 필요하지 않습니다.
13. 나머지 동물에 대해서도 이 절차를 반복합니다.
    참고: 숙련되면 동물 한 마리당 10-15분 안에 수술을 완료할 수 있으며, 특히 봉합사를 묶는 두 번째 사람의 도움을 받을 수 있습니다. 동일한 유리 모세관을 약 15-20회 수술 후 팁이 무뎌져 교체해야 합니다. 대조 수술은 리솔레시틴 대신 PBS를 척수에 주사하여 설명된 것과 동일하게 수행할 수 있습니다. 나중에 사용하기 위해 모세혈관을 청소하지 않는 것이 좋습니다.

결과

그림 1. 주입 주사기의 조립. (A) 주입 주사기의 너트를 유리 모세관의 평평한 끝에 끼운 다음 두 개의 페룰을 끼워 짝짓는 끝이 맞물립니다. 모세관이 원뿔형 페룰에 단단히 고정되면 어셈블리를 주입 주사기 끝에 손으로 단단히 조입니다. (B) 프라이밍 주사기에 부착된 금속 허브 바늘로 고무 디스크의 중앙을 조각하고 바닥으로 밀어 내립니다. (C) 프라이밍 주사기에 리솔레시틴 용액을 빼냅니다. (D) 바늘 끝에서 리솔레시틴의 첫 번째 방울이 보일 때까지 프라이밍 주사기를 부드럽게 누릅니다. (E) 주입 주사기의 배럴에 프라이밍 주사기를 삽입하여 고무 디스크로 단단히 밀봉합니다. 용액이 모세관 끝까지 흐를 때까지 용액을 부드럽게 누릅니다. 주입 주사기에 기포가 유입되지 않도록 금속 허브 바늘을 제거하기 위해 플런...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
봄 가위	정밀 과학 도구	15004-08
겸자	정밀 과학 도구	11254-20
견인기	정밀 과학 도구	17003-03
클리퍼스	필립스	QG3330
가열 회수 챔버	페코 서비스	V1200
수술용 테이프	3M	1527-1
메스 손잡이	정밀 과학 도구	10003-12
메스 칼날	깃털	제15위
스펀지 창	비버 비지텍	581089
5-0 비크릴 봉합사	에티콘	J511G
곡선형 터프컷 스프링 가위	정밀 과학 도구	15123-12
32 게이지 금속 바늘	BD	305106
바늘 홀더	정밀 과학 도구	12002-14
각진 집게	정밀 과학 도구	11251-35
코튼 팁 어플리케이터	청교도	806-WC
거즈 패드	안전 크로스 응급 처치	3763
10μL 주사기	해밀턴	7635-01	밀폐 주사기가 아닌 마이크로리터를 구입하십시오
압축 피팅	해밀턴	55750-01	2개의 페룰과 탈착식 너트가 포함되어 있지만 10μL 주사기와 함께 제공되는 너트가 더 꽉 맞습니다
프라이밍 키트	해밀턴	PRMKIT	프라이밍 주사기, 탈착식 허브 바늘 및 고무 디스크가 포함되어 있습니다
미리 당겨진 유리 모세관	WPI	TIP10TW1 (10개 팩)	내경이 10μm인 모세관이 포함되어 있습니다. 30 μm 내경도 작동 (TIP30TW1)
입체 프레임	데이비드 코프(David Kopf) 악기	모델 900
초음파 세척기	피셔 사이언티픽	FS-20
현미경 슬라이드	폭스바운드	48311-703
명시야 현미경	올림푸스	BX51
리소포스파티딜코인	시그마	L1381
PBS	옥소이드	BR0014
이소프로필 알코올	시그마	109827
케타민	CDMV
자일라진	기상청
요오드	웨스트 페네톤	2021년
바셀린 바셀린	폭스바운드기	CA05971

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