1. 배지 및 시약의 준비
- 배양 플레이트용 기저 멤브레인 매트릭스 코팅을 4°C에서 해동합니다(기저 멤브레인 매트릭스가 예열되지 않도록 합니다. 그렇지 않으면 응고됩니다). 1mL 부분 표본을 만들어 -20 °C 또는 -70 °C에서 보관하십시오.
- 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에서 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 10μg/mL로 재구성하고 10μL 분취량을 만듭니다. 4°C에서 보관하십시오.
- 글루타민이 함유된 DMEM/F12의 미개봉 500mL 새 병에 B27(10mL), N2(5mL) 및 페니실린-스트렙토마이신(5mL)을 추가합니다. 이 신경줄기세포(NSC) 배지 50mL를 원뿔형 튜브에 넣고 10μL의 10μg/μL(최종 2μg/mL) bFGF를 추가합니다. NSC(+) bFGF 배지를 4°C에서 보관합니다.
- (-) bFGF 미디어를 만들려면 1.3단계에서 설명한 것과 동일한 레시피를 사용하되 bFGF를 추가하지 마십시오. 이 배지는 NSC를 뉴런으로 분화하고 분화 후 뉴런 배양을 유지하는 데 사용됩니다.
2. 렌티바이러스 구조체
참고: 렌티바이러스 구조체에 대한 작업을 시작하기 전에 실험실이 생물 안전성 레벨 2(BSL-2) 제제를 사용하도록 승인되었는지 확인하십시오. 또한 렌티바이러스 벡터로 작업할 때 BSL-2 배양 후드, 개인 보호 장비(PPE) 및 폐기 방법을 사용해야 합니다.
- 선호하는 출처에서 렌티바이러스로 패키징된 타우 구조체를 얻습니다.
3. 인간 신경줄기세포 배양
참고: NSC는 일반적으로 100,000–150,000 cells/cm2에서 파종되며 대부분의 상업적으로 이용 가능한 NSC는 1 x 106 cells/vial로 판매됩니다. 이 프로토콜은 10cm 세포 배양 접시에 최적화되어 있습니다(다른 크기의 접시가 사용될 수 있음). 그러므로, 상업적으로 이용 가능한 NSC가 사용되는 경우, 10cm 접시를 파종하기에 충분한 세포를 얻기 위해 먼저 6웰 접시에서 배양하여 NSC를 확장해야 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 세포 배양 접시 크기에 맞게 조정할 수 있습니다.
- 세포 배양 플레이트를 준비하기 위해 세포 배양 플레이트용 동결된 기저막 매트릭스 코팅의 부분 표본 하나를 제거하고 4°C에서 해동합니다(세포 파종 전날 밤새 4°C에서 부분 표본을 배치할 수 있음). 385μL의 기저막 매트릭스 코팅을 5mL의 DMEM/F12 배지 + 페니실린-스트렙토마이신에 추가합니다.
참고: 5mL의 DMEM/F12 배지 + 페니실린-스트렙토마이신은 10cm 접시 하나를 코팅하기에 충분합니다(이 기저 멤브레인 매트릭스 코팅 용액 1mL는 6웰 접시 중 1웰을 코팅하기에 충분합니다). 또는 세포를 고정하고 면역 염색하거나 티오플라빈으로 염색해야 하는 경우, 24웰 배양 접시에서 유리 커버슬립의 배양 세포를 사용할 수 있습니다.
- 배지와 매트릭스 코팅을 배양 접시에 추가하기 전과 첨가하는 동안 차갑게 유지하십시오. 배양 접시에 기저막 매트릭스 코팅을 추가하고 접시를 인큐베이터(37°C)에 1시간 동안 놓습니다. 최적의 코팅을 위해 기저막 매트릭스를 1시간 이상 또는 미만으로 배양하지 마십시오. 1 시간 후, 세포 배양 접시에서 기저막 매트릭스 코팅을 흡인합니다. 이것이 NSC가 플레이팅할 준비가 된 것과 일치하는지 확인하십시오.
참고: 세포가 냉동 재고에서 해동되지 않는 경우 3.2단계를 건너뛰고 3.3단계를 계속합니다.
- 얼어붙은 NSC 스톡에서 세포를 해동하는 경우 얼어붙은 세포가 담긴 바이알을 가져다가 물속에서 바이알을 앞뒤로 움직여 37°C로 가열된 수조에서 따뜻하게 합니다. 해동되면 바이알에 70% 에탄올을 분사하고 세포 배양 후드에 넣습니다. 세포를 ~10mL의 DMEM/F12 + 페니실린-스트렙토마이신 배지로 옮기고 1,000 x g의 실온에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 배지를 흡인하고 NSC 배지에서 세포를 재현탁합니다.
- NSC 배지에서 세포를 희석하여 사용 중인 세포 배양 용기에 적합한 시딩 밀도를 얻습니다.
참고: 예를 들어, NSC가 6웰 플레이트에 도금되는 경우(6웰 배양 접시의 웰 하나가 표면적이 9cm2인 경우) 파종하는 데 900,000에서 1,350,000개의 세포가 필요합니다. 따라서 1,000,000개의 세포가 들어 있는 하나의 바이알을 2mL의 배지에 재현탁시키고 6웰 접시의 단일 웰에 첨가할 수 있습니다.
- NSC 배지에 부유하는 세포를 충분히 추가하여 기저막 매트릭스로 코팅된 배양 접시(100,000 cells/cm2)를 파종하고 격일로 배지를 교체합니다(냉동 스톡을 사용하는 경우 도금 다음 날과 그 이후에는 격일로 배지 교체). 75%-80% 융합될 때까지 세포를 성장시킵니다.
참고: 세포는 도금 직후 75%-80% 합류점에 도달할 가능성이 높지만 냉동 스톡을 사용하는 경우 더 오래 걸릴 수 있습니다. 위치
- NSC가 75%–80% 융합되면 NSC(+) bFGF 배지를 제거하고 NSC(-) bFGF 배지로 대체하여 신경 세포 분화를 시작합니다. 이 배지의 세포를 최소 4주 동안 배양합니다(격일로 배지 교체).
참고: 세포는 bFGF 철수 후 며칠 동안 계속 분열합니다. 따라서 세포는 90-100% 합류점에 도달할 수 있습니다.
- 4주 동안 배양한 후 세포는 뉴런 운명을 달성하고 렌티바이러스를 치료할 준비가 됩니다.
4. 신경 세포 배양의 형질도입 및 유지
- 렌티바이러스로 뉴런을 형질도입하려면 3.4 x 105 형질 전환 가능 단위/세포의 역가 수를 사용합니다(100% 합류 10cm 접시에는 ~1,000만 개의 뉴런이 포함됨). transducible units를 세포 배양 배지에서 필요한 농도로 희석하고 세포에 추가합니다(세포 배양 접시에 정상적인 부피의 배지 사용). 렌티바이러스를 첨가한 후 2일 후, 세포를 새로운(-) bFGF 배지(렌티바이러스 없음)로 1x 세척하고 평소와 같이 (-) bFGF 배지에서 배양을 계속합니다.
- 렌티바이러스 후 치료의 경우, 격일로 세포 배양 배지([-] bFGF 배지)를 변경하여 형질도입된 뉴런에 영양을 공급합니다. 형질도입 후 ~8주 동안 세포를 유지하십시오. 생존 가능성을 보장하기 위해 광학 현미경으로 세포를 정기적으로 시각화합니다.
참고: 희박성 또는 수지상 파손은 세포가 더 이상 생존할 수 없다는 신호입니다.
