자가 혈액 주입에 의해 유도된 지주막하 출혈 쥐 모델 구축

초록

출처: Bömers, J. et al. 쥐 모델에서 실험적 지주막하 출혈을 유도하기 위한 자가혈액의 사전 키아스마틱, 단일 주입. J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오는 지주막하 출혈 쥐 모델을 설정하는 절차를 보여줍니다. 마취된 쥐에게는 두개내압과 뇌혈류를 측정하기 위해 프로브를 이식합니다. 표적 부위가 확인되고 바늘이 chiasmatic 전 위치에 삽입됩니다. 그런 다음 자가 혈액을 지주막하 공간으로 주입하여 두개내 압력을 높이고 뇌 혈류를 감소시켜 모델을 확립합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 준비

사항

1. 삽관을 위해 16G 말초 정맥 카테터를 수정합니다. 수정하려면 바늘을 1cm 줄이고 나머지 원위 1cm를 주입 밸브 쪽으로 30° 구부립니다. 카테터 날개를 제거합니다(여러 번 사용).
2. 두개내 압력 또는 ICP 프로브를 만들려면 20mm의 폴리에틸렌 튜빙 조각(내경(ID): 0.58mm, 외경(OD): 0.96mm)을 자르고 한쪽 끝을 태워 열린 루멘을 유지하면서 원형 플레이트를 만듭니다. 1mm의 실리콘 튜브(ID: 1.0mm, OD: 3.0mm)를 연결하기 전에 10mm의 실리콘 튜브(ID: 0.76mm, OD: 2.4mm)로 폴리에틸렌 튜브를
우회합니다.
3. 노트북의 전원을 켜고 데이터 수집 소프트웨어를 엽니다. 제조업체의 지침에 따라 혈압(BP) 및 뇌내압(ICP) 변환기와 레이저 도플러를 보정합니다.
4. 혈액 가스 분석기 장치를 준비합니다.
   주의: 기화기에 이소플루란이 충분한지 확인하십시오.
5. O2 및 대기 기류를 켭니다. O₂의 흐름을 30%로, 대기 공기를 70%로 설정합니다.
6. 가열 패드를 놓고 온도를 37°C로 설정합니다.

2. 마취

1. 쥐를 O₂의 30 %와 대기 공기의 70 %의 흐름으로 마취실에 놓습니다. 이소플루란 가스 5%를 챔버에 투여합니다. 적절한 마취는 약 4분 정도 소요됩니다. 호흡을 조심스럽게 조절하십시오.
2. 마취되면 쥐를 고무 밴드로 둘러싸인 무거운 판 위에 누운 자세로 놓습니다. 쥐의 앞니를 고무줄 아래에 놓습니다.
3. 구부러진 집게로 혀를 조심스럽게 빼냅니다. 면봉으로 후두를 청소하십시오. 목구멍의 정중선에 외부 조명을 놓아 성대를 시각화합니다.
4. 변형된 16G 말초 정맥 카테터를 사용하여 흡기하는 동안 삽관합니다. 올바르게 삽입되면 스틸레토를 제거하십시오. 카테터를 인공호흡기에 연결합니다.
   메모: 튜브의 올바른 배치는 호흡 수와 일치하는 흉부 움직임으로 확인됩니다. 복부의 움직임이 보이면 발관하고 쥐를 마취벨에 다시 넣습니다. 기도가 손상될 위험이 있으므로 절차를 세 번 이상 반복하지 마십시오.
5. 삽관할 때 동물에게 30%의_O2와 70%의 대기 공기로 인공 호흡을 유지하십시오. 마취를 이소플루란의 1.5%-3%로 유지하십시오. 혈압을 80-100mmHg 사이로 유지하기 위해 이소플루란을 조정합니다.
6. 호흡기의 흡기량을 3mL로 유지하고 빈도를 40-45 inspirations/min으로 유지합니다.혈액 가스 분석에 따라 흡기량을 조정합니다.
7. 2-0 봉합사로 뺨의 안쪽 연조직을 꿰매어 바릅니다. 주사관과 말초 정맥 카테터의 주사 밸브 주위에 봉합사를 묶어 카테터를 고정합니다.
8. 쥐를 수술장으로 옮기고 꼬리가 외과 의사를 향하도록 앙와위 자세로 눕힙니다.
9. 안구 건조증을 해소하기 위해 필요할 때 아이젤을 바르십시오.
10. 적절한 마취 깊이를 확인하기 위해 발가락 꼬집기를 수행합니다. 수술 중 마취 깊이를 평가하고 유지합니다.

3. 꼬리 카테터

1. 0.5%의 클로르헥시딘 에탄올로 꼬리의 근위 3-4cm를 소독하십시오.
   메모: 이제부터는 외과 의사의 재량에 따라 수술용 현미경을 사용하십시오.
2. 복부 쪽 꼬리의 근위 끝에서 15-20mm 피부를 절개합니다. 동맥을 절개하지 않도록 주의하세요.
3. 구부러진 집게를 사용하여 아래에 있는 결합 조직에서 피부를 풀어줍니다.
4. 동맥을 노출시키는 근막을 조심스럽게 관통합니다.
5. 구부러진 집게를 사용하여 아래 조직에서 꼬리 동맥을 조심스럽게 분리합니다.
6. 세 개의 검은 비단실을 그릇 아래에 밀어 넣습니다. 실 하나를 가능한 한 멀리 놓고 동맥 주위에 수술 매듭을 단단히 묶습니다. 지혈기로 실의 느슨한 끝을 잡습니다.
7. 나머지 두 개의 실을 동맥 주위에 느슨하게 묶습니다.
8. 근위 스레드를 가능한 한 근접하게 밉니다. 근위 실의 끝을 잡기 위해 지혈제를 적용합니다. 지혈을 가볍게 당기되 혈류를 제한하고 차단하기에 충분합니다. 복부에 지혈제를 놓습니다.
9. 카테터의 끝을 45° 각도로 자릅니다. 동맥벽 침투를 방지하기 위해 날카로운 부분을 자릅니다.
10. Vannas 가위를 사용하여 원위 매듭에서 3-5mm 떨어진 30° 각도로 동맥 직경의 1/3을 동맥 절개합니다.
11. 두 개의 직선 집게를 사용하여 카테터를 동맥에 삽입합니다. 한 집게를 사용하여 카테터를 잡고 다른 집게를 사용하여 카테터 위의 동맥을 조심스럽게 당깁니다.
12. 카테터를 혈관 위로 삽입하여 근위 매듭까지 삽입하고 지혈구에서 매듭을 풉니다. 카테터의 혈류를 시각화합니다. 중간 실을 카테터에 느슨하게 고정합니다.
13. 동맥이 근막으로 다시 덮인 지점까지 계속 삽입하고 가능하면 바로 너머로 삽입하십시오.
14. 카테터 배치와 식염수로 씻어내어 누출 가능성을 제어합니다.
15. 수술 매듭을 사용하여 두 개의 근위 실을 고정합니다.
    메모: 혈압 측정은 맥동적이어야 합니다. 그렇지 않으면 카테터가 제대로 삽입되지 않은 것입니다.
16. 절개 부위 끝에 카테터를 고정하려면 말단 실을 사용하여 수술 매듭을 묶습니다.
17. 피부 절개 부위를 두 개의 비흡수성 모노필라멘트 4-0 봉합사로 느슨하게 꿰매십시오. 카테터를 관통하지 않도록 주의하십시오.
    메모: 수술 내내 맥동의 진폭을 인식하십시오. 이 수치가 낮으면 카테터를 식염수로 씻어내십시오.
18. 혈액 가스 샘플링을 위한 혈류를 허용하기 위해 압력 변환기에서 동맥 카테터를 풉니다. 카테터 끝에 미세모세관 튜브를 놓습니다. 혈액이 튜브로 흐르도록 합니다. 채혈 후 카테터를 변환기에 다시 부착하고 카테터를 세척합니다.
19. 혈액 가스 분석기에 모세관 튜브를 삽입합니다. pH, pCO₂ 및 pO₂를 측정하고 기록해 둡니다
    알림: 혈액 가스 및 혈압 값에 따라 인공호흡 속도를 변경하십시오. 평균 동맥압(MAP)이 너무 낮으면 이소플루란의 유속을 낮추십시오. 적절한 마취 깊이를 확인하기 위해 반사 신경을 테스트하십시오.

4. ICP 프로브

1. 쥐를 입체 안경테에 놓습니다. 쥐를 대칭으로 배치하는 것이 중요합니다.
2. 정위 안경테 아래에 원통형 베개를 놓아 목의 전방 굴곡을 만듭니다.
3. 쥐의 두피, 목, 귀 뒤를 면도합니다. 불필요한 머리카락을 제거하십시오.
4. 0.5%의 클로르헥시딘 에탄올로 해당 부위를 소독하십시오.
5. 아드레날린이 분출되는 10 mg/5 μg/mL 리도카인 0.7 mL를 국소적으로 마취하고, 정중선에 있는 두개골의 꼬리 끝에 바늘을 삽입한다. 0.3-0.4 mL를 목의 근육 조직에 주사하십시오. 나머지는 브레그마 주변과 앞쪽에 피하로 주사합니다.
6. 바늘로 정중선에서 꼬리 방향으로 ~8mm 찔러 피부를 절개합니다.
7. 모든 근육을 뭉툭하게 층으로 해부하여 대서양 후두막(대리석 색깔의 삼각형, 꼬리 방향으로 정중선의 두개골)을 식별합니다.
8. 목 근육 조직을 구속하기 위해 Alm 견인기를 사용하십시오. 필요한 경우 갈래 견인기를 꼬리 방향으로 놓습니다.
9. 멸균 ICP 프로브가 ICP 변환기에 연결되어 있는지 확인하십시오. ICP 프로브를 식염수로 세척합니다. ICP 프로브에 기포가 없는지 확인하십시오.
10. 23G 바늘을 사용하여 대서양 후두막을 절개합니다. 멤브레인을 통해 ICP 프로브를 동축할 수 있는 구멍을 만듭니다.
11. 대서양후두막을 통해 프로브를 부드럽게 감아냅니다. 프로브를 가볍게 당기고 0-5mmHg 범위의 맥동 곡선이 표시되는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 프로브를 제거하고 변환기에 대한 연결을 확인한 다음 루멘을 통한 흐름을 확인하십시오.
12. 조직 접착제를 두 방울 떨어뜨립니다. 1mm 실리콘 튜브를 멤브레인 쪽으로 앞으로 이동하고 접착제를 추가로 도포하여 ICP 프로브 변위의 위험을 최소화합니다.
13. 견인기를 제거합니다.
14. 절개 부위의 두부 끝에 수평 매트리스 봉합사 1회를 만들고 비흡수성 모노필라멘트 4-0 봉합사를 사용하여 꼬리 끝에 간단한 단속
매트리스 봉합사 1회를 만듭니다.

5. 바늘과 레이저 도플러 프로브의 배치

1. 눈 바로 앞쪽의 정중선, 꼬리 방향으로 15mm 절개합니다.
2. 겸자로 결합 조직과 근육을 제거합니다. 멸균 면봉의 끝을 루진으로 사용하여 브레그마와 관상 봉합사를 식별할 수 있습니다.
3. Alm 견인기를 배치합니다.
4. 정위 안경테에 25G의 척추 바늘을 놓습니다. 바늘을 브레그마에 정확히 놓고 위치를 기록하십시오.
   메모: 입체계 프레임의 정중선 조인트를 수직면에서 동물을 향해 30°로 배치합니다.
5. 브레그마에서 바늘을 제거하고 프레임을 앞으로 65mm 이동 한 다음 정중선의 바늘을 교체하여 드릴링 부위를 표시하십시오.
6. 경막이 뼈 아래에서 식별될 때까지 드릴링합니다. 곧은 집게를 사용하여 뼈 조각을 부드럽게 제거하고 골랍으로 구멍을 채웁니다.
7. 브레그마 오른쪽으로 3-4mm 측면으로 레이저 도플러를 위한 관상 봉합사 바로 앞쪽에 또 다른 구멍을 뚫습니다. 뼈를 끝까지 뚫을 필요는 없습니다. 경막을 관통하지 않도록 주의하십시오.
8. 레이저 도플러가 혈류를 측정할 수 있는 혈관을 찾으십시오. 레이저 도플러를 놓고 값을 확인합니다. 최소값은 100FU가 필요합니다. 현미경(인공 조명)을 제거합니다.
9. 값이 여전히 허용 가능한 경우 접착제 한 방울을 추가하여 프로브를 고정합니다.
10. 값이 80FU 이상인지 다시 확인합니다. 값이 80FU 미만인 경우 80FU.
    이상의 값에 도달하도록 프로브를 제거하고 위치를 변경합니다. 참고: FU 값은 뇌혈류(CBF)를 나타내는 임의의 단위입니다.

6. 지주막하 출혈(SAH) 유도

1. 두개골 기저부의 저항이 느껴질 때까지 반구 사이의 정중선에 있는 두개골을 통해 바늘을 부드럽게 삽입합니다. 바늘을 1mm 후퇴시켜 시신경 바로 앞쪽에 올바르게 배치되도록 합니다.
2. 바늘 끝이 오른쪽을 가리키도록 바늘을 시계 방향으로 90° 돌리면 혈액을 주입할 때 가장 균일한 결과를 얻을 수 있습니다. 스틸레토를 분리합니다(그림 1).
3. 15분 동안 평형을 유지하고 마취 수준을 조정하여 80-100mmHg 범위의 평균 동맥 혈압을 얻습니다.
4. 혈액 가스 분석을 수행합니다. 그에 따라 마취 수준을 조정하십시오.
5. 뭉툭한 23G 바늘이 있는 1mL 주사기를 사용하여 꼬리 카테터에서 500μL의 혈액을 추출합니다.
6. 공기 주입을 피하기 위해 척추 바늘 챔버의 죽은 공간을 혈액으로 채우십시오. 혈액이 채워진 주사기에서 23G 바늘을 제거하고 주사기에 300μL의 혈액이 들어 있는지 확인합니다.
7. 주사기를 척추 바늘에 연결합니다. 단단히 잡고 수동으로 혈액을 주입하여 MAP을 능가합니다.
8. 랩탑에서 ICP의 가파른 상승과 CBF의 가파른 하락을 관찰합니다.
   메모: 수술이 성공적이려면 CBF가 기준선 점수와 비교하여 최소 50% 이하여야 합니다(그림 2 참조). 가짜 쥐는 6.1-6.7 단계를 거치지 않으므로 척추 바늘이 대뇌에 삽입되지 않고 자연 출혈 및 의인성 뇌 손상을 최소화합니다.

결과

그림 1: SAH 유도 전 설정 개요. 그림 상단에서 1) 주사 바늘, 2) 레이저 도플러 프로브 및 3) ICP 프로브가 모두 제자리에 있습니다.

그림 2: 척수강내 주입 후 시료 추적. 빨간색 그래프는 혈압을 mmHg 단위로 보여줍니다. 파란색 그래프는 mmHg 단위의 ICP를 나타내고 녹색 그래프는 임의 단위 FU의 CBF를 나타냅니다. ICP의 급증은 혈액 주입의 결과입니다. 이로 인해 CBF가 5분 이상 기준선의 50% > 떨어집니...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
16G 말초정맥 카테터	BD 벤플론	393229	바늘이 짧아지고 원위가 1cm 구부러져 있습니다. 날개 제거
마취 벨/챔버	알 수 없음
혈액 가스 분석기	복사계	ABL80
혈압(BP) 모니터	보조 기기	ML117	Powerlab에 연결
곡선 집게, 12cm x 3	F.S.T	11001-12	마취용
원통형 베개, 28cm x 4cm	홈메이드		수술용 수건으로 만든
데이터 수집 하드웨어	보조 기기	ML870 파워랩
데이터 수집 소프트웨어	보조 기기	랩차트 6.0
드릴	KMD	1189
드릴 컨트롤러	실프라덴트	300인치
플렉시블 라이트	쇼트	쿠알라룸푸르200
발열 패드	민코	1135
피하 주사 바늘, 20g	KD메디컬	301300	입체식 프레임에 연결
ICP 모니터	보조 기기	ML117	Powerlab에 연결
이소플루란 기화기	오메다	TEC3
노트북	레노버	T410
레이저 도플러 모니터	애드인스트루먼트	ML191
레이저 도플러 프로브	옥스퍼드 옵트로닉스	MSF100XP	레이저 도플러 모니터에 연결
바늘 홀더, 13cm	F.S.T	12001-13	마취용
정밀 주사기, 0.025 mL	해밀턴	547407
입체 프레임	코프 인스트루먼트	M900
수술용 현미경	칼 자이스	F170
봉합 바늘	알가이어	1245	마취용
온도 조절기	주식회사 CWE	TC-1000
변환기 x 2	보조 기기	MLT0699	BP 및 ICP 모니터에 연결
인공호흡기	우고 바실레	7025
동물용 가위	애스큘라프	GT421
3구 블레어 견인기, 13.5cm	아그토스	17022--13
블런트 알름 견인기	F.S.T	17008-07
곡선 집게, 12cm x 2	F.S.T	11001-12
바늘 홀더, 13cm	F.S.T	12001-13
스트레이트 뒤몽 집게, 11cm	F.S.T	11252-00
스트레이트 홀스테드-모스키토 지혈제 x 2	F.S.T	13008-12
스트레이트 아이리스 가위, 9cm	F.S.T	14090-09
스트레이트 반나스 가위, 10.5cm	F.S.T	15018-10
흡수성 면봉	케텐바흐	31603
검은 명주실, 4-0, 5 x 15 cm	뵈멜	14,757
뼈 왁스	에스큘라프	1029754
카보머 아이 젤 2 mg/g	파라노바
면봉	하인즈 헤렌츠	WA-1
코튼 팁 어플리케이터 x 4	셀레파	120788
피하 주사 바늘, 23G x2	KD메디컬	900284	스톱콕에 연결합니다. 말단부 제거
피하 주사 바늘, 23G x3	KD메디컬	900284	말단부를 제거합니다. 2개는 스톱콕에, 1개는 주사기에 연결
ICP 프로브:	홈메이드		다음과 같이 만들어졌습니다:
폴리에틸렌 튜브, 20 mm	스미스 메디컬	800/100/200	내경(ID): 0.58mm, 외경(OD): 0.96mm.
실리콘 튜브, 10 mm	어부	15202710	ID: 0.76mm, OD: 2.4mm.
실리콘 튜브, 2 mm	어부	11716513	ID: 1.0mm, OD: 3.0mm.
마이크로 헤마토크릿 튜브	브랜드	7493 11
OP-수건, 45 cm x75 cm	묄리케	800430
PinPort 어댑터, 22G	인스텍	PNP3F22
PinPort 인젝터	인스텍	PNP3M	위치
폴리에틸렌 튜브, 2 x 20 cm	스미스 메디컬	800/100/200	주사기에 연결합니다. ID: 0.58mm, OD: 0.96mm.
고무줄	알 수 없음
메스, 10 블레이드	키아토	23110
척추침, 25 G x 3.5''	브라운	5405905-01
스톱콕 시스템, 디스코픽스 x 2	브라운	16494C	변환기에 연결
봉합사, 4-0, 모노필, 비흡수성 x 3	에티콘	EH7145H
주사기, 1 mL	BD 플라스티팍	1710023
주사기, 루어락, 10 mL x 4	BD 플라스티팍	305959	변환기에 연결
조직 접착 접착제	3M	1469SB
0.5% 클로르헥시딘 스피릿	파보그 제약	210918
카프로펜 50 mg/mL	스캔벳	43715	희석 1:10
이소플루란	박스터
등장성 식염수	암그로스	16404
리도카인-아드레날린 10 mg/5 μg/mL	암그로스	16318

위치