유세포분석을 사용한 뉴런의 다중 미토콘드리아 파라미터 측정

초록

출처: Liang, K. X., et al. 인간 유도 만능 줄기 세포와 그 신경 및 신경교 유도체의 다중 미토콘드리아 매개변수에 대한 유세포 분석. J. Vis. 특급 (2021)

이 동영상은 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체, 미토콘드리아 DNA 관련 단백질 및 미토콘드리아 외막 단백질에 대한 항체로 신경 세포를 라벨링한 후 유세포 분석을 통해 그 수준을 정량화하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 고정 세포에서 MRC(미토콘드리아 호흡 사슬) 복합 소단위 및 TFAM(미토콘드리아 전사 인자 A)의 유세포 분석 측정

1. 배양 기간이 끝나면 세포 해리 시약을 첨가하여 세포를 분리하고(~10⁶) 그런 다음 15mL 튜브에 세포를 펠렛하고 수집합니다. 인산염 완충 식염수(PBS)(1x)를 사용한 원심분리로 300 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 두 번 세척합니다.
2. 실온(RT)에서 1.6% 파라포름알데히드(PFA)(15mL 튜브에 1.6% PFA 1mL)로 세포를 10분 동안 고정합니다. PBS(1x)로 원심분리하여 300×g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 두 번 세척합니다.
3. -20°C에서 20분 동안 얼음처럼 차가운 90% 메탄올(15mL 튜브에 90% 메탄올 1mL)으로 세포를 투과합니다.
4. 0.3M 글리신, 5% 염소 혈청 및 1% 소 혈청 알부민(BSA) - 분획 V PBS(1x)(15mL 튜브에 1mL의 차단 완충액)가 포함된 차단 완충액에서 샘플을 차단합니다. PBS(1x)를 사용한 원심분리로 세포를 두 번 세척합니다.
5. 복합체 I 소단위체 측정을 위한 항NDUFB10(1:1,000), 복합체 II 소단위 측정을 위한 항숙시네이트 탈수소효소 복합 플라보단백질 소단위 A(SDHA, 1:1,000), 복합체 IV 소단위 측정을 위한 anti-COX IV(1:1,000), Alexa Fluor 488(1:400)과 결합된 항-TFAM(미토콘드리아 전사 인자 A) 항체와 같은 1차 항체를 30분 동안 세포에 배양합니다. Alexa Fluor 488(1:400)과 접합된 anti-TOMM20(외부 미토콘드리아 막 20의 트랜스로케이스) 항체로 30분 동안 동일한 수의 세포를 별도로 염색합니다(15mL 튜브에 1mL의 1차 항체 용액, 항체에 대한 자세한 내용은 재료 표 참조).
6. PBS (1x)를 가진 세포를 300 × g에서 5 분 동안 300 g에 원심 분리로 한 번 세척하십시오. 2 차 항체 (1 : 400)를 NDUFB10, SDHA 및 COX IV의 튜브에 추가하고 30 분 동안 이러한 용액으로 세포를 배양합니다.
7. 300 × g에서 5분 동안 원심분리하여 PBS(1x)로 세포를 한 번 세척합니다. 상층액을 흡인하여 튜브에 약 100μL를 남깁니다. 세포 펠릿을 300μL의 PBS(1x)에 재현탁합니다. 세포를 얼음 위의 어두운 곳에 보관된 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
8. 유세포 분석기의 세포를 분석합니다(3개의 파란색 및 1개의 빨간색 레이저 구성). 530/30 대역통과 필터를 사용하여 필터 1(FL1)의 신호를 검출합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Alexa Fluor 488	아브캠	AB198308	1차 항체; 1000 μL 염색 용액에서 1 : 400, 2.5 μL로 사용; 마우스 단클론 IgG2b Alexa Fluor® 488을 동형 대조군으로 사용합니다.
Alexa Fluor 488과 결합된 anti-TOMM20	산타크루즈 생명공학	Cat# sc-17764 RRID:AB_628381	1차 항체; 1000 μL 염색 용액에서 1 : 400, 2.5 μL로 사용; 마우스 단클론 IgG2a Alexa Fluor® 488을 동형 대조군으로 사용합니다.
반NDUFB10	아브캠	AB196019	1차 항체; 1:1000, 1000 μL 염색 용액에서 1 μL로 사용; Alexa Fluor ® 488 염소 항토끼 IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 # A-11008)를 2차 항체로 사용; 토끼 단클론 IgG를 동형 대조군으로 사용합니다.
반SDHA	아브캠	AB137040	1차 항체; 1:1000, 1000 μL 염색 용액에서 1 μL로 사용; Alexa Fluor ® 488 염소 항토끼 IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 # A-11008)를 2차 항체로 사용; 토끼 단클론 IgG를 동형 대조군으로 사용합니다.
안티 콕스 IV	아브캠	ab14744, RRID:AB_301443	1차 항체; 1:1000, 1000 μL 염색 용액에서 1 μL로 사용; Alexa Fluor ® 488 염소 항-마우스 IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 # A-11001)를 2차 항체로 사용; 마우스 단클론 IgG를 동형 대조군으로 사용합니다.
PBS 1배	써모 피셔 사이언티픽	18912014	세척 단계에 사용
포름알데히드(PFA) 16%	써모 피셔 사이언티픽	28908	세포 고정
글리신	시그마-알드리치	G8898	버퍼를 차단하는 데 사용됨
소 혈청 알부민	유로파 바이오 제품	EQBAH62-1000	면역염색 분석에서 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위한 차단제 및 CDM 성분

과 결합된 anti-TFAM