모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

Summary

우리는 모델 herpesvirus, 감마 herpesvirus 68 (γHV68)의 lytic 복제에 호스트 신호 분자의 핵심 역할을 식별 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 유전자 변형 마우스 긴장과 γHV68 lytic 복제 배아 섬유 아세포를 활용, 프로토콜 phenotypic 특성화 및 바이러스 lytic 복제에서 바이러스 호스트 상호 작용의 분자 심문을 모두 할 수 있습니다.

Abstract

바이러스 감염에 대한 응답으로, 호스트는 바이러스 시토 킨 생산 ^1,2로 이어질 타고난 면역 신호 경로를 활성화 등 다양한 방어 반응을 개발하고 있습니다. 호스트를 이식하기 위해서는, 바이러스는 호스트 항 바이러스 반응을 회피하고 신호 경로를 조작 할 고맙게 여기게됩니다. 호스트 바이러스 상호 작용을 이루는 물질은 바이러스 감염에 대한 소설 치료 전략의 개발에 빛을 발산합니다.

손쥐 γHV68은 밀접하게 인간의 종양 발생 Kaposi 육종 - 관련 herpesvirus 및 Epsten - 바 바이러스 ^3,4에 관한 것입니다. 실험실 쥐 γHV68 감염은 인간 herpesviruses를 사용할 수 없습니다 생체에서 호스트 응답 및 바이러스 감염의 전체 과정을 검토 할 수있는 다루기 쉬운 작은 동물 모델을 제공합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 γHV68 lytic replic에 phenotypic 특성에 대한 방법의 패널 및 호스트 신호 구성 요소의 분자 절개를 제시생체 및 예 생체 내 두 ation. 유전자 변형 마우스 종자의 사용 가능 여부는 생체 내 γHV68 급성 감염시 호스트 신호 경로의 역할의 심문을 할 수 있습니다. 또한 이러한 결함 마우스 종자로부터 격리 마우스 배아 섬유 아세포의 (MEFs는) 추가 γHV68 lytic 복제 예를 생체 동안 이러한 분자의 역할을 해부하는 데 사용할 수 있습니다.

virological 및 분자 생물학의 assays 사용하여, 우리는 호스트 바이러스 상호 작용의 분자 메커니즘을 정확히하고 바이러스 lytic 복제에 필수적 호스트 및 바이러스 유전자를 식별 할 수 있습니다. 마지막으로, 세균 인공 염색체 (BAC) 시스템은 특별히 호스트 바이러스 상호 작용을 방해 바이러스 요소 (들)에 변이의 도입을 용이하게한다. 이러한 변이를 들고 재조합 γHV68는 구성 요소를 신호 키 호스트의 결함 MEFs의 γHV68 lytic 복제 phenotypes을 요점을 되풀이하는 데 사용할 수 있습니다.이 프로토콜은 생체 및 예 생체 내 개입의 여러 수준에서 호스트 병원체 상호 작용을 심문 할 수있는 훌륭한 전략을 제공합니다.

최근, 우리는 γHV68 usurps 타고난 면역 신호 경로는 바이러스 lytic 복제 ⁵ 증진 것을 발견했습니다. 특히, γHV68 드 노보 감염 면역 키나제 IKKβ를 활성화하고 활성화 IKKβ는 바이러스 전사 활성화를 촉진하기 위해 마스터 바이러스 전사 인자, 복제 및 transactivator (RTA)을 phosphorylates. 그렇게함으로써, γHV68 효율적으로 커플 타고난 면역 활성화를 개최하기위한 전사 활성화함으로써 바이러스 트랜 스크립트 등의 lytic 복제를 촉진. 이 연구는 호스트 바이러스 상호 작용을 조사하기 위해 다른 바이러스에 적용 할 수있는 훌륭한 예를 제공합니다.

Protocol

1. γHV68와 마우스 감염

1. 로 6 년 8 주 오래된, 성별 일치 littermate 마우스 (8-12 마우스 / 그룹)은 바이러스 감염에 사용됩니다. 쥐가 선적 후 사 전체 일 (96 시간) 이상 순응 할 수 있습니다.
2. 바이러스를 사용하여 프로토콜 단계는 표준 BSL2주의를 사용하여 바이오 안전성 수준 2 (BSL2)의 캐비닛에서 수행해야합니다.
3. 단지 실험하기 전에 마우스를 당 멸균 PBS의 30 μl에 γHV68의 (40 1 개 10 ⁵ 상패 - 성형 장치 [PFU는]) 바이러스 정지를 준비합니다. 얼음 바이러스 정지세요.
4. 마우스 진정 작용을 위해 케타민 / xylazine 솔루션을 (1.5 MG의 케타민과 0.15 MG xylazine/20 g의 체중, 100 μl / 마우스) 준비합니다. 쥐가 발가락 핀치를 수행하여 회복 될했는지 확인합니다.
5. 1.5 MG의 케타민 및 내부 - 복막 주입 20 MG의 체중 (100 μl / 마우스) 당 0.15 밀리그램의 xylazine으로 마취 마우스.
6. 드롭 현명한에 intranasally 바이러스 정지 (30 μl / 마우스)를 제공진정제를 마우스 중 하나가 콧 구멍에 패션.
7. 5 한쪽에 마우스를 놓는다....

Discussion

바이러스 감염에 대응 MAVS에 의존 타고난 면역 신호 경로는 바이러스 염증성 크린 시토 킨 ^10-14의 생산을 촉진하기 활성화됩니다. 인간의 종양 발생 Kaposi 육종 - 관련 herpesvirus과 엡스타인 - 바 바이러스 ^3,4의 모델 바이러스로 손쥐 γHV68를 사용하여, 우리는 γHV68 usurps MAVS - IKKβ 경로는 전사 활성화 ^5를 통해 바이러스 lytic 복제를 홍보 할 것을 발견했습니다. 유전자 변형 MEFs와 분자 바이러스학의 기술을 도입,이 프로토콜은 γHV68 lytic 복제에 대한 중요한 특정 경로의 구성 요소를 신호의 효율적인 식별 할 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜은 생체 감염, 예 생체 lytic 복제 및 본래 면역 신호 경로의 해부에 수반. 재조합 헤르페스를 생성하는 세균 인공 염색체를 포함하여 분자 메커니즘을 추가 절차를 윤곽을 그리다하려면바이러스 및 분자 생물학 실험이 필요.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
전기 MAX DH10B 능력 세포	Invitrogen	18290-015
Methylcellulose	시그마	M0512
POWERPREP HP 플라스미드 Miniprep 시스템	OriGene	NP100004
POWERPREP HP 플라스미드 Midiprep 시스템	OriGene	NP100006