인간 세포에서 γ-Secretase 활성을 측정하기 위한 Luciferase 분석

초록

출처: Wang, B., et al., Quantitative Measurement of γ-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms(세포 기반 루시페라제 리포터 분석 플랫폼에서 -세크레타제 매개 아밀로이드 전구체 단백질 및 노치 절단의 정량적 측정). J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 테트라사이클린 유도 시스템을 사용하여 유전자 변형 인간 세포에서 γ-secretase 활성을 측정하는 절차를 보여줍니다. 이 과정에는 테트라사이클린으로 APP 유전자 발현을 유도하고, 아밀로이드 β 펩타이드를 생성하고, 루시페라아제 생산을 활성화하는 것이 포함됩니다. 그런 다음 루시퍼라제-기질 반응으로 인한 생물 발광을 측정하여 γ-secretase 활성을 반영합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. APP-C99(아밀로이드 전구체 단백질 - C-말단 99-아미노산 단편)의 γ-분비효소 절단에 해당하는 Luciferase Reporter 신호 측정

참고: CG (C99-Gal4) 세포의 생성에 대한 자세한 설명은 이전 출판물을 참조하십시오.

1. Dulbecco의 Modified Eagle Medium(DMEM)과 10% 소 태아 혈청(FBS), 5μg/mL blasticidin, 250μg/mL 항생제(예: zeocin) 및 200μg/mL hygromycin B로 구성된 성장 배지에서 200μL/well의 최종 부피로 CG 세포(20, 000 cells/well)를 96-well microplate에 파종합니다.
   1. 혈구계(hemocytometer)로 세포를 세십시오.
   2. 마이크로플레이트를 가습된 CO₂ 인큐베이터로 옮기고 37°C에서 밤새 배양합니다.
2. 각 웰에서 100μL의 성장 배지를 제거합니다.
3. 0.2% 디메틸설폭사이드(DMSO), 2μM CL-387,785, 2μM N-[N-(3,5-디플루오로페나세틸-L-알라닐)]-S-페닐글리신 t-부틸레스터(DAPT) 또는 기타 관련 ErbB1/ErbB2 억제제와 함께 2μg/mL 테트라사이클린을 포함하는 100μL/웰의 성장 배지를 추가합니다.
4. 처리된 CG 세포를 37°C에서 24시간 동안 마이크로플레이트에서 배양합니다.
5. 마이크로플레이트에서 150μL/웰 성장 배지를 제거합니다.
6. 50μL/웰 루시페라제 분석 시약을 추가합니다(재료 표 참조).
7. 마이크로플레이트를 발광 마이크로플레이트 리더로 옮깁니다.
   1. 마이크로플레이트를 실온에서 부드럽게 저어주면서 5분 동안 유지합니다.
8. 발광 마이크로플레이트 리더에 저장된 사전 정의된 프로그램을 사용하여 Firefly 루시퍼라제(FL) 방출 발광을 측정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
VictorLight 발광 플레이트 리더	퍼킨엘머	2030-0010
클래스 II, 유형 2 생물 안전 캐비닛	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	1300 시리즈 A2
재질 보기 CL-387,785	EMD 칼바이오켐	233100-1MG
대시	머 크	565770
Dulbecco의 변형 독수리 매체(DMEM)	써모 피셔	12100046	성장 매체의 주요 compnent
소 태아 혈청(FBS)	써모 피셔	16000044
블라스티시딘	써모 피셔	A1113903
제오신	써모 피셔	R25005
하이그로마이신 B	지브코	10687010
혈구세포	시그마-알드리치	BR717805 알드리치
96웰 마이크로플레이트	눕크	156545
테트라사이클린	시그마	T7660
디메틸설폭사이드(DMSO)	시그마	D2650
Steady-Glo 루시퍼라아제 분석 시약	프로메가	E2510
가습 CO2 인큐베이터	레브코	울티마 II
T-REx293 세포주	인비트로젠	R71007
Wallac 1420 소프트웨어 버전 3.0	퍼킨엘머		Luminescence Microplate Reader의 기기 제어 소프트웨어

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