마우스 뇌 절편에서 유전자좌 coeruleus 영역을 식별하기 위한 면역조직화학(Immunohistochemistry)

초록

출처: Schmidt, K. et al., 마우스 뇌에서 코에룰루스 궤변의 국소화. J. Vis. 특급 (2019)

이 프로토콜은 마우스 뇌 절편에서 유전자좌 coeruleus 영역을 식별하기 위해 면역조직화학을 사용하는 방법을 설명합니다. 녹색 형광단 표지 항체로 도파민 β-하이드록실라제를 표적으로 삼음으로써, 노르에피네프린 생성 뉴런은 현미경에서 녹색 형광으로 시각화됩니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.

1. 브레인 슬라이싱

1. 3% isoflurane의 신청에 의하여 쥐를 움직이지 않게 하고, 마취하기 위하여.
   1. 면봉에 이소플루란 방울을 적셔 15mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 동물의 코를 튜브에 넣고 이소플루란을 흡입하도록 합니다. 발가락 꼬집음에 대한 반응이 없어 마취의 깊이를 확인하십시오.
2. 동물을 등에 눕히고 복부에 접근할 수 있는 동안 T 핀으로 사지를 고정하여 움직이지 못하게 합니다.
3. 수술 용 가위로 동물을 자르고 복부 피부를 자르고 흉부 부위의 피부를 자릅니다. T-핀을 사용하여 피부를 고정합니다. 그런 다음 복막을 흉부까지 절단합니다. 흉강을 부수고 횡격막을 절단하여 심장을 노출시킵니다.
4. 동물에서 혈액이 흘러나올 수 있도록 오른쪽 심방을 자릅니다. 25게이지 바늘이 있는 10mL 주사기를 좌심실에 삽입하고 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 관류합니다.
   참고: 이것은 용액이 전신 순환을 통해 흐르고 우심방을 통해 빠져나갈 수 있도록 합니다.
5. 10mL 주사기를 제거하고 60mL 주사기에 부착된 25게이지 바늘을 삽입합니다. 좌심실을 통해 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA) 50mL를 관류합니다.
   1. 10% PFA 용액을 H₂O에 희석하고 최종 4% PFA 용액을 4°C에서 냉각하여 얼음처럼 차가운 4% PFA 용액을 준비합니다.
6. 쥐의 머리를 분리하고 두개골에서 뇌를 제거합니다.
   1. 목의 피부를 잘라낸 다음 눈 쪽으로 잘라 두개골을 드러냅니다. 목에서 코까지, 그리고 한쪽 안구에서 다른 쪽 안구로 두개골을 부수십시오. 두개골을 벗겨내고 뇌 전체를 절제한다.
7. 4 °C에서 24 시간 동안 4 % PFA로 뇌를 배양합니다.
8. 겸자로 뇌를 25mL의 30% 자당 용액으로 채워진 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 뇌가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 48-72시간 동안 4°C로 유지하십시오.
9. 성인 마우스 뇌 슬라이서 매트릭스 관상동맥으로 중뇌(브레그마 후방~3mm)를 통해 뇌를 절단합니다. 뇌간을 포함하는 뇌 부분을 유지하십시오.
   참고: 이것은 두 개의 뇌 절편을 초래할 것입니다 – 하나는 피질의 대부분을 포함하는 것(절단의 앞쪽)과 뇌간/소뇌(절단의 뒤쪽)를 포함합니다. 다음 단계에서는 브레인스 섹션을 사용합니다.
10. 최적 절단 온도 화합물(OCT)로 둘러싸인 임베딩 몰드의 바닥에 절단면이 놓인 뇌간 단면을 삽입합니다. 내장된 Brain을 -80°C 냉동고로 옮기고 더 사용할 때까지 최소 12시간 동안 얼립니다.
11. 저온 유지 장치에서 절단: OCT에서 뇌를 포함하는 임베딩 몰드를 저온 유지 장치에 놓습니다. 몇 시간 동안 저온 유지 장치에서 배양하여 뇌 블록의 온도를 저온 유지 장치의 온도로 조정합니다.
12. 임베딩 주형을 벗겨내면 뇌가 들어 있는 OCT 블록이 드러납니다.
13. 면도날을 사용하여 뇌를 건드리지 않고 블록 표면에서 과도한 OCT를 제거합니다.
14. OCT 블록을 저온 유지 장치의 척에 장착하여 뇌의 절단면이 앞쪽으로 노출되도록 합니다.
15. 뇌의 절단면을 저온 유지 장치의 면도날과 평행한 방향으로 조정하십시오.
16. 수질에서 시작하여 뇌를 다듬어 100μm 부분을 가로로 자릅니다.
17. 소뇌와 뇌간이 하나의 연속된 조각으로 절단될 때까지 앞뒤로 자릅니다. 50μm 두께의 슬라이스 수집을 시작합니다.
    참고: 수질에서 가로로 잘라내면 뇌간과 소뇌가 두 개의 별도 부분으로 절단됩니다. 주관절 부분에서 뇌간과 소뇌는 결국 제4뇌실 수준에서 합쳐집니다. 제4심실의 측면 가장자리가 잘 형성되면 소뇌와 뇌간이 하나의 연속적인 조각으로 나옵니다.
    1. 집게로 OCT로 둘러싸인 뇌 절편을 모아 PBS로 채워진 24웰 플레이트의 우물에 넣습니다(그림 1a). 소뇌좌(locus coeruleus, LC)는 소뇌와 하구(inferior colliculus)가 브레그마의 ~-5.52mm 후방에서 서로 만날 때 가장 두드러집니다(그림 2b).
       참고: 소뇌가 완전히 절제되고 더 이상 브레그마 후방의 ~-5.34mm에서 하구를 둘러싸지 않으면 LC의 가장 앞쪽 부분이 사라집니다(그림 2c).

2. 도파민 β-하이드록실라제(DBH) 또는 티로신 하이드록실라제(TH)에 대한 면역조직화학(그림 1)

1. 1일차
   1. 선택한 조각을 PBS에서 5분 동안 세 번 씻습니다.
   2. 4°C에서 세제(PBSD)가 포함된 0.5% 인산염 완충 식염수에 24시간 동안 투과합니다.
      1. PBS 25mL에 세제 125μL를 희석합니다.
2. 2일차
   1. 0.5% PBSD를 5분 동안 3회 세척합니다.
   2. 4°C에서 0.5% PBSD에 1:500으로 1:500 희석하여 18시간 동안 1차 항체인 anti-DBH 또는 anti-TH를 추가합니다.
3. 3일차
   1. 슬라이스를 0.5% PBSD로 10분 동안 세 번 씻습니다.
   2. 원하는 2차 항체(녹색 형광을 위한 488 당나귀 항토끼)를 16시간 동안 0.5% PBSD에 1:1000의 희석액으로 추가합니다.
   3. 24웰 플레이트를 알루미늄으로 감싸고 4°C에 놓습니다.
   4. 0.5% PBSD를 5분 동안 3회 세척합니다.
   5. PBS에서 5분 동안 세탁합니다.
   6. 연필 브러시로 조각을 물통에 옮깁니다.
   7. 물 속에 떠 있는 슬라이스를 충전된 슬라이드에 장착합니다.
   8. 하드셋 마운팅 미디어가 있는 커버슬립 섹션: 도파민 베타-하이드록실라제
   9. 장착된 뇌 부분을 실온에서 30분 동안 건조시킵니다.
   10. 컨포칼 또는 형광 현미경에서 적절한 2차 항체 형광단 파장의 신호를 검출할 수 있는 설정으로 뇌 절편을 이미지화합니다.
   11. 현미경을 뇌 절편의 초점면으로 조정하고 10X 배율로 단일 이미지를 촬영합니다.

결과

그림 1: DBH 또는 TH에 대한 뇌 절편을 면역염색하여 LC를 검출. (a) 하나의 쥐 뇌를 뇌간 주위로 50μm 조각으로 절단하고 2개의 24웰 접시에 수집했습니다. 5번째에서 8번째마다 수집된 뇌 절편을 XFM을 통한 이미징을 위해 필름으로 덮인 커버슬립에 장착했습니다. 이 조각은 우물 사이에 파란색 숫자로 표시되어 있습니다. PBS에 떠 있는 인접한 슬라이스는 DBH가 LC(웰에 적십자 표시)를 검출하도록 면역 염색되었습니다. 녹색 원은 DBH 신호에 대해 양수 슬라이스를 나타내므로 LC를 포함합니다. (b) LC를 포함하는 관상 뇌 절편을 DBH로 면역 염색하고 컨포칼 현미경에서 이미지화했습니다. 이미지는 LC의 강한 신호(녹색)를 보여줍니다. (c) LC를 함유하는 코로나 절편을 티로신 하이드록실라...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
성체 마우스 뇌 슬라이서 매트릭스	지빅 악기	BSMAS001-1
항토끼 2차 항체, Alexa Fluor 488 (출처 - 당나귀)	써모 피셔 사이언티픽	A-21206
충전된 유리 슬라이드	제네시	29-107
컨포칼 현미경	자이스	LSM 800
극저온 조절기	마이크로름	HM 505E
저온 유지 장치 절단 블레이드	써모 피셔 사이언티픽	MX35
가위 미니, 9.5cm	앤테크 진단	503241
다피(4',6-디아미디노-2-페닐린돌)	시그마-알드리치	D9542-10MG
도파민 β-하이드록실라제(DBH) 항체 - 자체 생산(공급원 - 토끼)	B. 아이퍼	-
Dopamine β-hydroxylase (DBH) 항체 - 상업적으로 이용 가능 (출처 - 토끼)	세포 신호전달	8586
팔콘 튜브, 50ml	미국 사이언티픽	339652
유공(이소플루오란)	박스터	NDC 1019-360-60
겸자 마이크로 애드슨	앤텍 진단	501245
하드셋 마운팅 미디어	전자공학	17984-24
현미경	파스칼	LSM 5
멀티웰 플레이트, 웰 24개	써모 피셔 사이언티픽	930186
최적 절삭 온도 컴파운드(OCT)	VWR/ 티슈 테크	102094-106
파라포름알데히드(PFA)/포르말린 10%	피셔 사이언티픽	SF98-4
Peel-A-Way 일회용 임베딩 금형	폴리사이언스 Inc.	18646A
연필 브러시
인산염 완충 식염수(PBS)	생명기술	14190250
면도날	아마존	ASIN: B000CMFJZ2
주걱	앤텍 진단	14374
T 핀	오피스 디포	344615
입체좌표의 쥐 뇌, Paxinos and Franklin, 3판	아마존	ISBN: 978-0123694607
Triton-X 100 (PBSD 준비용)	시그마-알드리치	T8787
트윈 20	시그마-알드리치	P7949-500ml
Tyrosine hydroxylase (TH) 항체 (출처 - 토끼)	EMD 밀리포어	AB152
광시야 형광 현미경	자이스	악시오 Zoom.V16