초파리에서 폐쇄성 두부 외상성 뇌 손상을 입히는 방법

초록

출처: Katzenberger, R. J., et al., 초파리에서 폐쇄성 두부 외상성 뇌 손상을 입히는 방법. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 초파리에서 폐쇄두부 외상성 뇌손상(TBI)을 유도하기 위해 고충격 외상(HIT) 장치를 사용하는 방법을 보여줍니다. TBI는 신경 기능에 영향을 미치는 기계적 뇌 외상을 유발하며, 이는 시간이 지남에 따라 신경 퇴행과 사망으로 이어집니다.

프로토콜

1. HIT 장치 구성

1. 2개의 클램프와 4개의 나사를 사용하여 스프링을 보드에 부착합니다(그림 1A). 보드의 너비를 기준으로 클램프를 중앙에 놓고 외부 클램프를 보드의 가장자리와 같은 높이로 사용하여 서로 맞눕니다. 클램프를 부착하기 전에 스프링에 단단히 맞도록 펜치를 사용하여 구부립니다.
   참고: HIT 장치를 구성하는 데 필요한 재료에 대한 설명은 표 1을 참조하십시오. 스프링의 클램프 끝은 보드 가장자리에서 1/8인치(3.2mm) 떨어져 있어야 하고 자유 끝은 보드 위로 3/4인치(19mm) 확장되어야 합니다. 보드의 길이와 평행이 되도록 스프링을 조정합니다.
2. 스프링의 자유 끝을 벨크로 루프의 접착 스트립으로 한 번 감쌉니다. 벨크로의 바깥쪽 가장자리는 스프링 끝과 같은 높이가 되어야 합니다. 벨크로는 단단한 압축 피팅을 만들어 바이알을 스프링에 고정하는 데 사용되기 때문에 중요합니다. 또한 벨크로를 사용하면 바이알을 쉽게 연결하고 제거할 수 있어 많은 바이알을 단기간에 처리할 수 있습니다.
3. 얼음 양동이 덮개를 거꾸로 놓고 중앙에 놓고 나무 판에 단단히 밀착시킵니다. 얼음 양동이 덮개의 돌출된 부분이 긴 가장자리가 보드의 너비와 평행이 되도록 방향을 지정합니다. 얼음 양동이의 돌출 부분은 나무 판자보다 1/2인치(13mm) 높기 때문에 유리병을 스프링에 부착할 때 스프링이 보드에 평평하게 놓이지 않습니다.
4. 얼음 양동이 덮개가 보드와 물체 사이에 끼어 움직이지 않도록 전체 장치를 벽과 같은 고정된 물체에 밀어 넣습니다.
5. 종이 각도기를 판지 플라이 바이알 트레이의 바닥에 테이프로 붙이고 보드 길이에 대해 가장자리에 세워 90° 표시가 스프링과 정렬되도록 합니다.

2. HIT 장치의 작동

1. 빈 바이알에 마취된 파리 1마리에서 60마리 사이₂마리를 넣고 꽉 끼는 면봉으로 바이알을 막습니다.
2. 바닥에서 1인치(2.5cm)가 될 때까지 면봉을 바이알에 밀어 넣어 파리를 바이알의 바닥 1인치(2.5cm)로 제한합니다. 바이알의 1인치(2.5cm) 표시에 선을 긋는 것이 도움이 됩니다. 파리를 바이알의 더 크거나 더 작은 영역에 국한시키는 것은 표현형의 중증도에 영향을 미칠 수 있습니다.
3. 파리가 CO₂에서 이동성을 회복할 때까지 5분 동안 기다립니다. CO₂의 영향을 완전히 제거하는 데 5분이 충분한지 여부는 알려져 있지 않습니다.
4. 벨크로의 안쪽 가장자리가 바이알 상단과 같은 높이가 될 때까지 스프링 끝을 바이알에 삽입합니다(그림 1B). 스프링이 평평하게 놓여 있을 때 바이알의 1인치(2.5cm)가 얼음 양동이 덮개의 돌출된 부분과 겹쳐야 합니다. 바이알은 여러 번 재사용할 수 있습니다.
5. 앉아 있는 동안 왼손의 엄지와 검지를 사용하여 바이알을 벨크로 부분에 갖다 댑니다. 오른손을 사용하여 보드를 벤치탑에 단단히 잡습니다. 또는 C-클램프를 사용하여 보드를 벤치탑에 단단히 고정합니다.
6. 스프링을 원하는 각도로 완벽하게 똑바로 당깁니다. 스프링을 풀어줍니다. 스프링이 완전히 멈추도록 하십시오.
7. 스프링에서 바이알을 제거하고 파리가 ≥5분 동안 회복할 때까지 기다립니다. 파리를 한 번 더 공격하거나 파리를 파리 먹이가 든 유리병으로 옮깁니다.
   참고: HIT 장치에서 타격의 표현형 효과를 평가하기 위해 다양한 분석을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 수명에 미치는 영향은 부상 후 때때로 생존하는 파리의 비율을 분석하여 결정할 수 있고, 뇌 형태에 미치는 영향은 머리의 조직학적 분석으로 결정할 수 있으며, 유전자 발현에 미치는 영향은 mRNA 수준의 정량적 분석을 통해 결정할 수 있습니다.
8. 타격을 받지 않는 방제 파리를 동일하게 처리하여 타격으로 인한 것이 아닌 절차의 효과를 결정합니다. 바이알이 얼음 양동이 덮개에 충격을 가하면 큰 소리가 나므로 청력 보호구를 착용하십시오.

결과

그림 1: HIT 장치의 다이어그램. (A) 상단 그림 view 휴식 위치에 있는 HIT 장치의 모습. (B) HIT 장치의 측면 그림. 스프링은 정지 위치(진한 빨간색)로 표시되고 90°(연한 빨간색)로 편향됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아연 도금 압축 스프링	힐만 그룹	540189	9 7/8인치(길이), 15/16인치(외경), 0.12인치(와이어 크기)
나무판			9인치(길이), 6.5인치(너비), 0.75인치(높이)
클램프	시그마 전기 제조 회사	49822	3.10인치(길이), 0.68인치(너비), 1.11인치(높이), EMT 2홀 스트랩, 1인치 강철 EMT 도관에 대한 유형 클릭
접착식 벨크로의 절반 고리			3인치(길이), (3/4인치 너비)
폴리우레탄 얼음 양동이 커버	피셔 사이언티픽	02-591-45	9 1/8인치(길이), 9 1/8인치(너비), 1 1/4인치(높이)
플라스틱 플라이 바이알	응용 과학	AS-510	3 11/16인치(높이), 1 1/16인치(내경), 1 1/8인치(외경)
큰 면봉	피셔 사이언티픽	22-456-883
종이 각도기			10인치(직경)