동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 렌티바이러스 조제 (선택 단계)
- 10ml DMEM/10% FBS가 있는 곳에서 만들고 ~60-70% confluence까지 성장하도록 각 렌티바이러스에 대해 HEK293T 세포의 10cm 플레이트 3개를 분할합니다. 37°C의 인큐베이터에서 5% CO2로 세포를 성장시킵니다.
- 6.4 μg CAG-Flex-GFP 렌티바이러스 벡터, 1.2 μg pMD2.G(VSV-g 인코딩), 1.2 μg pRSV-Rev 및 1.2 μg pMDLg/pRRE. 세 가지 렌티바이러스 패키징 벡터는 상업적으로 이용 가능합니다.
메모: 이 접근법은 3세대 lentiviral 벡터를 사용하지만, 2세대 벡터 및 관련 plasmids도 사용할 수 있습니다.
- 렌티바이러스와 접촉하거나 렌티바이러스를 포함하는 모든 용액 또는 장치를 비활성화하기 위해 BSL2 인증 후드 내에 10% 표백제 용액이 들어 있는 폐기물 용기를 준비합니다. 다음으로, 표백제 용액에 형질 주입 후 4-6시간 후에 배지를 완전히 제거하고 동일한 부피의 새 배지로 교체한 다음 세포가 성장할 수 있도록 합니다.
- 4일 후, 배지를 50ml 원뿔형 튜브에 모으고 1,000 x g에서 15분 동안 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다. 다음으로, 0.45μm 멤브레인을 통해 상층액을 여과합니다. PVDF와 같은 낮은 단백질 결합 필터는 잘 작동합니다. 주의: 고체 및 액체 바이러스 폐기물을 모두 표백제 용액에 넣습니다.
- 여과된 상등액 30ml를 초원심분리기 튜브와 초원심분리기에 넣습니다. 100,000 x g에서 4°C에서 2.5시간 동안 원심분리기.BSL2 후드의 원심분리기 튜브를 열고 상층액을 10% 표백제로 제거합니다. 펠릿에 ~100μl의 PBS를 첨가하면 1x107 - 1x108 infectious units/ml의 역가가 생성됩니다. 다음날 분취하여 -80°C에서 보관합니다. 렌티바이러스 분취액은 -80°C에서 최소 6개월 동안 안정적입니다.
- 중요 고려 사항: 현재 많은 기관이 바이러스 코어를 보유하고 있습니다. 최적의 결과를 위해 최소 역가가 1x107 infectious units/ml인 농축 바이러스를 획득합니다.
2. MGE 해부를 위한 기증자 마우스
- 먼저, Cre-발현 관심 라인과 야생형(WT) 마우스 또는 Cre 매개 재조합 후 리포터를 발현할 마우스 사이에 시간 제한 짝짓기를 설정합니다.
메모: 많은 Cre 드라이버 라인은 형질전환 적이며 반접합 상태에서 유지 및 사육됩니다. 따라서 배아의 절반만이 Cre 전이유전자를 포함할 것입니다. DNA는 Cre 대립유전자를 검출하기 위해 짧은 PCR을 위해 배아에서 신속하게 준비할 수 있습니다. 그런 다음 원하는 유전자형의 MGE 조직만 사용하도록 Cre+ 배아를 수확할 수 있습니다. 또는 Cre 의존성 리포터를 사용하여 MGE 절제 및 이식을 위한 배아를 선택할 수 있습니다.
- E13.5에 해당하는 요일을 계산합니다. 동물이 전날 저녁에 짝을 이룬 경우 플러그 날짜는 0.5입니다. 기증자 조직이 E13.5가 되는 날 출생 후(P)1 마우스를 갖는 시간을 맞추기 위해 시간 제한 임신 마우스 또는 P1 새끼를 가진 WT 암컷을 주문하십시오. 또는 기증 동물을 짝짓기 일주일 전에 집에서 이러한 짝짓기를 설정하십시오.
메모: E13.5 및 P1 배아/새끼를 같은 날에 모두 생성하는 이전 전략은 종종 안정적으로 수행하기 어렵습니다.
3. 미디어, 도구 및 장비 준비.
- MGE 세포 준비를 위한 시약과 도구를 준비합니다(표 1).
- 깨끗한 표면을 준비하고 깨끗한 집게, 가위 및 미세 수술 용 칼 또는 미세 집게 (정확한 조직 해부를 위해)를 표면에 놓습니다.
- 해부를 위해 Hank's balanced salt solution(HBSS)을 준비하고 transduction을 위해 10% 소 태아 혈청(FBS)이 포함된 Dulbeco의 변형 독수리 배지(DMEM)를 준비합니다.
- 37°C 조직 배양 인큐베이터에서 20-30ml DMEM/10% FBS를 약 1시간 동안 전배양합니다. 매체의 가스 교환 및 pH 평형을 허용하기 위해 뚜껑을 열어야 합니다.
메모: 배지 사전 배양은 해부를 시작하기 직전에 준비할 수 있습니다.
4. MGE 세포 준비
- 승인된 동물 프로토콜에 따라 임신한 쥐를 희생시키고 배아를 얼음처럼 차가운 HBSS가 들어 있는 10cm 페트리 접시에 넣습니다.
- 해부 내시경을 사용하여 각 배아에서 뇌를 제거한 다음(한 번에 하나씩 수행, 나머지 배아는 얼음처럼 차가운 HBSS에 남겨두음) MGE 조직을 잘라냅니다.
메모: 아래 및 그림 1에는 MGE를 제거하는 방법을 보여주는 주요 단계가 자세히 설명되어 있습니다.
- 복부 쪽이 위를 향하도록 뇌를 위치시킵니다(그림 1A, A'). 참고: 등쪽이 위를 향하도록 하는 것도 괜찮습니다. 시상면을 따라 뇌를 반으로 잘라 두 조각을 만듭니다. 반절제된 뇌의 예가 나와 있습니다(그림 1B, B'). 뇌의 등쪽(위에 있는 피질)과 복부 측면이 신경절 저명성(ganglionic eminence, GE) 조직을 덮고 둘러싸고 있다는 점에 주목하십시오.
- 다음으로, 주로 사용하는 손으로 매우 미세한 집게나 찌르는 칼(표 1)을 잡고 주로 사용하지 않는 손으로 잡은 집게로 반구를 움직이지 못하게 합니다. (반구의 내측 측면은 위를 향해야 합니다.) 집게와 찌르기 칼로 등쪽과 복부 조직을 펼쳐 기저에 있는 GE 조직을 드러냅니다(그림 1C 및 그림 1C' 다이어그램).
메모: 박리 페트리 접시에서 일부 매체를 제거하면 MGE 해부를 수행하는 동안 조직을 더 쉽게 안정화할 수 있습니다.
- 찌르는 칼이나 가는 집게로 똑바로 절단하여 CGE, LGE 및 중격 조직을 분리합니다(빨간색 점선으로 표시된 절단 예, 그림 1D 및 D' 참조). 이러한 절단은 어떤 순서로든 할 수 있습니다.
메모: MGE를 주변 조직에서 잘라낸 '상자'라고 상상해 보십시오. 이렇게 하면 각 절개에 대해 유사한 절단을 재현 가능하게 만드는 데 도움이 되므로 조직 절제의 변동성을 줄일 수 있습니다.
- 마지막으로 MGE를 옆으로 돌리고 바닥(뇌의 측면 측면)을 잘라냅니다. 이것은 MGE의 나머지 부분에서 MGE의 맨틀 영역(그림 1E 및 1E'에서 폐기)을 제거합니다. MGE의 나머지 측면은 주로 MGE의 심실 영역과 심실 영역 부분을 포함하며, 이는 거의 모든 MGE 전구 세포를 포함합니다. 이 조직을 계속 사용하십시오.
- 중요 고려 사항: 페트리 접시 바닥에 실리콘 젤을 추가하면 집게의 섬세한 끝을 보호하고 집게로 조직을 고정할 수 있는 부드러운 표면을 제공하기 때문에 우수한 해부 표면이 될 수 있습니다.
5. 렌티바이러스 라벨링 및 이식
- MGE 조직 튜브를 BSL2 인증 후드로 옮기고 배지를 제거합니다.
메모: MGE 조직은 눈에 보일 만큼 충분히 크며 튜브 바닥에 가라앉아 차가운 매체를 쉽고 부드럽게 제거할 수 있습니다.
- 37°C 조직 배양 인큐베이터에서 사전 배양된 ~500μl의 DMEM/10% FBS 배지를 추가합니다. 다음으로, 폴리브레렌을 첨가하여 8μg/ml의 최종 농도에서 각 튜브에 대한 형질도입을 용이하게 합니다. MGE 조직을 tricutation하여 P1000 피펫 팁을 사용하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 마지막으로 각 튜브에 농축된 렌티바이러스를 ~15-20μl를 추가합니다.
- 중요 고려 사항: 10-12회의 분쇄는 단일 배아에서 MGE 조직을 분해하기에 충분하지만, 여러 MGE가 함께 모인 경우 더 많은 분쇄가 필요할 수 있습니다. 다양한 트라이처레이션 조건을 시도하여 가장 적합한 조건을 결정하십시오.
- 각 튜브를 단단히 닫고 뒤집어 섞은 다음 모든 튜브를 37°C 인큐베이터에 넣습니다. 렌티바이러스의 세포를 최소 30분에서 최대 1시간 동안 배양하면 세포 생존력이 감소합니다. 시간이 다 될 때까지 10분마다 튜브를 뒤집습니다.
- 렌티바이러스로 배양한 후, 인큐베이터와 원심분리기에서 튜브를 ~700 x g에서 3분 동안 제거하여 세포를 펠릿화합니다. BSL2 후드에서 상등액을 제거하고 10% 표백제에 버립니다. 다음으로, 1ml DMEM/10% FBS를 첨가하고 펠릿을 2-3회 분쇄하여 세척한 다음 동일한 속도로 다시 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 이 세척 단계를 2-3회 더 반복하여 과도한 바이러스를 제거합니다.
메모: 4°C에서 원심분리 단계를 수행합니다. 그러나 RT에서 짧은 스핀을 수행할 때 감소된 생존력은 관찰되지 않았습니다.
- 최종 세척 후 가능한 한 많은 매체를 제거하고 각 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 튜브 측면의 잔류 배지로 인해 이식 절차가 시작될 때까지 ~2-3 μl의 배지가 세포 펠릿을 덮게 됩니다.
6. 이식 및 검증
- 숙주 P1 새끼를 획득하고 70% 에탄올을 분사하여 시술 영역을 준비합니다. 시술 중 무균 상태를 유지하려면 전용 클린 시술실에서 이러한 시술을 수행하는 것이 좋습니다. 또한 오토클레이브 수술 도구를 사용하고 70% 에탄올을 사용하여 강아지가 접촉할 표면을 살균하십시오. 이식을 수행하는 데 필요한 대표 장비 및 대표 시술 영역의 예가 그림 2.
에 나와 있습니다.
참고: 이 절차는 절개, 열린 상처 또는 봉합사가 필요한 수술이 아닌 소량의 주입이지만, 주입할 각 마우스에 대해 새 마이크로피펫을 사용하는 것이 좋습니다. 마이크로피펫은 70% 에탄올이 분사된 표면을 당겨 비스듬히 깎을 때 열 멸균 처리되어 밀봉된 용기에 보관됩니다.
- 팁의 직경이 40-80 μm 사이인 마이크로피펫을 생성합니다. 이러한 차원을 따르면 최적의 결과를 얻을 수 있습니다. 마이크로피펫을 당겨서 표면을 비스듬히 만들 때 가열멸균하고 마이크로피펫을 밀봉된 용기에 보관하기 전에 70% 에탄올을 분무합니다.
참고: 또는 이러한 바늘(표 1)을 만드는 데 필요한 장치에 대한 접근이 제한되는 경우 다른 주입 장치를 사용하십시오. 그러나 이들은 직경이 다르기 때문에 마이크로 피펫만큼 적합하지 않을 수 있습니다.
- 미네랄 오일을 1ml 주사기에 넣고 30 1/2G 바늘로 유리 피펫에 미네랄 오일을 완전히 채웁니다. 다음으로, 플런저를 입체택시 장치에 장착한 다음 유리 피펫을 입체택시 장치에 부착하고 플런저에 로드합니다. 유압 드라이브를 사용하여 플런저를 유리 피펫의 절반 정도로 움직여 깨끗한 종이 타월로 쏟아지는 미네랄 오일을 제거합니다.
- 주사기를 사용하는 대신 피펫의 뒤쪽 끝을 미네랄 오일에 담그고 모세관 작용으로 채우십시오. 피펫의 기포를 방지하려면 유리 피펫에서 완전히 나올 때까지 주사기에 양의 압력을 유지하십시오.
메모: MGE 세포를 성공적으로 이식하기 위해 다른 장치를 사용할 수 있습니다. 100nl보다 작거나 가까운 볼륨을 전달할 수 있는 모든 장치가 이 절차에 적합합니다.
- 다음으로, 멸균 종이 타월 또는 흡수성 재료를 사용하여 모서리를 미세한 점으로 꼬아서 MGE 세포 펠릿 위의 과도한 매체를 섬세하게 제거합니다. 이 단계는 더 작은 주입량을 달성할 수 있도록 세포 밀도를 집중시킵니다. 다음으로, 낮은 부피(P2 선호) 피펫을 사용하여 세포 펠릿을 천천히 끌어올리고 세포 현탁액을 소수성 표면으로 이동하기 전에 1-2회 분쇄합니다. 부피는 1μl 미만이어야 합니다. 바늘 끝을 셀 서스펜션으로 이동하고 유압 드라이브를 사용하여 셀 서스펜션을 피펫으로 끌어올립니다.
- 저체온증을 통해 P1 강아지를 마취합니다(라텍스 장갑으로 싸서 ~ 2-4분 동안 얼음에 올려 놓음). 유해한 자극으로 마취의 효과를 확인하십시오. 가는 집게로 발가락 사이의 피부를 꼬집습니다: 강아지는 꼬집으면 반응하지 않아야 합니다. 다음으로, 주입 장치 아래에 있는 곰팡이에 강아지를 놓고 머리의 피부를 뒤로 당기고 표준 실험실 테이프로 고정하여 피부를 팽팽하게 만듭니다.
메모: 저체온증은 신생아 마우스에 매우 효과적이며 사망률이 낮지만 새끼는 10분 이내에 회복하기 시작하므로 절차를 신속하게 수행해야 합니다. 또한, 얼음 위에서 4분은 견딜 수 있는 한계입니다. 주사에 더 오랜 시간이 필요한 경우 저체온증을 한 번만 유도하십시오. 그러나 강아지가 일찍 회복되면 다시 저체온증을 유발하기 전에 먼저 강아지가 완전히 회복되도록 하십시오. 또한 주사를 수행하기 위해 한 번만 저체온증을 유도하십시오.강아지는 저체온증 후 5-10분 이내에 회복됩니다. 이것은 새끼를 깔짚과 어미와 함께 두거나 강아지를 따뜻한 표면에 놓아 회복함으로써 촉진할 수 있습니다.
- 입체 장치를 사용하여 유리 피펫의 끝을 머리 표면에 수직으로 강아지 머리 표면에 놓습니다. 피펫이 머리에 닿으면 이를 '0'으로 간주합니다. 다음으로, 피펫을 피부와 두개골 표면을 통해 피질로 밀어 넣은 다음 피펫을 삽입하고 2 회 정도 넣은 다음 멈춥니다. 세포를 신피질로 최적으로 표적화하기 위해 마이크로피펫이 0.1mm 깊이에 있을 때 주사가 수행됩니다. 그러나 이는 사용자가 최적화해야 합니다(아래 참고 참조).
메모: 이 깊이는 위에서 설명한 장치로 더 깊은 신피질층을 안정적으로 표적으로 삼지만, 몇 가지 깊이는 경험적으로 테스트하고 결정해야 합니다. 또한, 각 부위에서 어떤 깊이가 최적인지 결정하기 위해 서로 다른 rostro-caudal 및 medio-lateral 위치에서 다양한 깊이를 테스트해야 합니다. 또한, 신피질로의 느린 침투는 조직을 깨끗하게 관통하는 능력을 감소시키기 때문에 초기 천공은 빨라야 합니다. 이 절차를 처음 시작할 때 다른 속도를 시도하여 가장 적합한 속도를 찾으십시오. 또한 좌표를 테스트하는 경우 염료가 위치를 나타내는 데 신뢰할 수 없었기 때문에 레이블이 지정된 셀을 사용하는 것을 대체할 수 있는 실질적인 방법이 없습니다.
- 바늘이 제자리에 놓이면 유압 장치를 회전하여 플런저를 유리 피펫으로 전진시켜 설정된 부피의 세포 현탁액을 피질로 밀어 넣습니다. 부위당 50-70nls를 주입합니다. 신피질 전체에 걸쳐 세포의 넓은 분포를 얻는 것이 목표인 경우 서로 다른 상부-꼬리 수준에 있는 3-6개의 다른 부위에서 이 절차를 반복합니다.
메모: 부피가 100 nl 이상이면 병변이 발생할 수 있으며 주입된 세포가 크게 덩어리져 주사 부위 밖으로 효율적으로 이동하지 못할 수 있습니다. 따라서 더 작은 주입량(~70nl 이하)이 시간이 허락하는 경우 더 많은 현장에서 최적입니다.
- 주사가 완료되면 스테이지에서 강아지를 제거하고 표시합니다(발가락 자르기는 나중에 강아지를 식별할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법입니다). 강아지가 회복되어 스스로 움직일 수 있게 되면(단계에서 제거한 후 몇 분 이내에 발생) 어미와 새끼와 함께 다시 눕힙니다.
메모: 이것은 최소 침습 절차이기 때문에 강아지가 자유롭게 움직이고 따뜻해지면 수술 후 절차가 없습니다. 그러나 강아지는 시술 후뿐만 아니라 다음 날에도 건강 악화의 징후가 없는지 확인해야 합니다.
- 다음 강아지에서 절차를 시작하기 전에 멸균 작업 영역을 유지하기 위해 70% 에탄올을 해당 부위에 분사하십시오. 주입된 새끼가 발달하도록 한 다음 적절한 발달 단계에서 조직을 평가합니다.
표 1. 시약 및 도구의 재고 목록.배지, 해부 도구, 이식을 위한 대표 장비 및 DNA 벡터를 포함하여 상업적으로 이용 가능한 시약의 목록. (해당 없음) 사용할 수 없거나 적용할 수 없습니다.
당
호
년
호
년
(영문)
년
호
호
호
)
의
년
년
년
년
| MGE 세포 준비 및 형질도입을 위한 시약 및 장비 | 카탈로그 # | 회사 |
| 1) | Dulbecco의 Modified Eagle Medium, 고포도 | 제12491-015 | 생명 기술 |
| 2) | 열 비활성화 소 태아 혈청 | 10437-077 | 생명 기술 |
| 3) | Hanks 균형 소금 용액 (HBSS), 칼슘 또는 마그네슘 없음 | 제14170-112 | 생명 기술 |
| 4) | 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브(또는 뚜껑이 있는 기타 수집 튜브) | 3810X | 에펜도르프 인터내셔널 |
| 5) | 폴리브레네 | 사우스캐롤라이나-134220 | SantaCruz 생명 공학 |
| 6) | 찌르기 나이프 스트레이트 22.5 ° (선택 사항) | 참조 : 72-2201 | 외과전문공사 |
| 7) | 페트리 접시(10cm), 조직 해부용 | FB0875713 | 피셔 사이언티픽 |
| 8) | 2 파인 팁 집게, Dumont #5와 같은 | 11254-20 | 정밀한 과학 도구 |
| 9) | 37 °C 조직 배양 인큐베이터, 5% CO2 입력 | C150 | 바인더 |
| 10) | 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브를 회전시킬 수 있는 탁상용 원심분리기 | | |
| 11) | 세포 분쇄에 사용할 수 있는 모든 P1000 피펫 | | |
| 12) | 생물 안전 레벨 2 후드 | | |
| 체외 MGE 1차 배양을 위한 시약 및 장비 | 카탈로그 # | 회사 |
| 1) | Lab-TekII 챔버 슬라이드(커버 포함), 8웰 | 154941 | 써모 피셔 |
| 2) | 폴리-L-라이신 0.1% 중량/부피 | P8920 | 시그마 알드리치 |
| 3) | 마우스 라미닌, 0.5-2 mg/ml | 23017-015 | 생명 기술 |
| 4) | Neurobasal 배지 | 제21103-049 | 생명 기술 |
| 5) | B27 세럼 프리 보충제 | 17504044 | 생명 기술 |
| 6) | 글루타맥스, 100x 주식 | 제35050-061 | 생명 기술 |
| 7) | 페니실린-스트렙토마이신, 100x 주식 | 제15070-063 | 생명 기술 |
| 8) | 포도당, (물에 25 % 용액을 준비하십시오) | G5400 | 시그마 알드리치 |
| MGE 세포 이식을 위한 시약 및 장비 | 카탈로그 # | 회사 |
| 1) | 1ml 주사기 | 참조 309602 | BD, Becton Dickinson 및 회사 |
| 2) | 30 1/2 G 바늘 | 305106 | BD, Becton Dickinson 및 회사 |
| 3) | 5μl를 제공하는 정밀 보어(플런저와 함께 제공) | 5-000-1005 | 드러먼드 사이언티픽 컴퍼니 |
| 4) | 파라필름 | 미세먼지(PM-999 | 폴리사이언스, Inc. |
| 5) ** | 붐스탠드가 있는 실체 현미경 | MZ6 | 라이카 |
| 6) ** | 디지털 마우스 입체 기기 전용 | 51725디 | 도둑질 회사 |
| 7) ** | 단축 오일 유압 미세 미세 조작기 | 미주리-10 | 나리시게 |
| 8) | 다이아몬드 코팅 로터리 베벨러 | 북미 | 집에서 만든 |
| 9) | 니들 피펫 풀러 | 730 | Kopf 악기 |
| 10) | 미네랄 오일 | 북미 | 모든 약국 또는 약국 |
| 11) | 1 μl의 부피를 안정적으로 측정할 수 있는 모든 피펫 및 팁 | | |
| ** 이것들은 우리가 사용하는 모델이지만 다른 많은 설정이 작동해야 합니다. | |
| 옵션 시약(렌티바이러스 제조용) | 카탈로그 # | 회사 |
| 1) | 25mm, 0.45μm 필터 | 09-719B | 피셔 사이언티픽 |
| 2) | 초투명 원심분리기 튜브(25 x 89mm) | 344058 | 벡크만 쿨터® |
| 3) | 리포펙타민 2000 | (1.5 ml사이즈) | 11668019 | 인비트로젠 |
| 기타 시판되는 소모품 | 카탈로그 # | 회사 |
| 1) | pMDLg/pRRE 플라스미드 인코딩 개그/폴 | 12251 | 애드진 |
| 2) | pRSV-Rev 플라스미드 인코딩 Rev | 12253 | 애드진 |
| 3) | pMD2.G 플라스미드 인코딩 VSVG | 12259 | 애드진 |
| 4) | pAAV-플렉스-GFP | 28304 | 애드진 |
