세포 외 단백질을 분리하기 위한 생쥐 뇌의 간질액의 미세투석

초록

출처: Yamada, K. 고분자량 차단 프로브를 사용하여 뇌 간질액에서 큰 세포외 단백질을 수집하는 생체 내 미세 투석 방법. 특급 J. Vis. (2018)

이 동영상은 미세 투석 프로브를 사용하여 마우스 뇌의 간질액(ISF)에서 세포 외 단백질을 수집하는 과정을 보여줍니다. 고분자량 컷오프 반투과성 멤브레인이 장착된 미세 투석 프로브는 이식된 가이드 캐뉼라를 통해 마취된 마우스의 뇌에 삽입됩니다. 펌프에 연결된 프로브는 생리학적 완충액이 뇌 조직을 관류하고 ISF와 혼합할 수 있도록 합니다. ISF의 단백질은 반투과성 멤브레인을 통해 확산되고 분석을 위해 수집됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 수술 전 절차

1. 수술을 시작하기 전에 70% 에탄올로 모든 것을 닦아 멸균 상태를 유지하십시오.발열 패드를 사용한 열 지지를 권장합니다.
2. 클로랄 수화물(400mg/kg)의 복강 내 주사로 마우스를 마취합니다. 발가락 꼬집기를 수행하여 마취를 확인합니다. 유도 시 meloxicam SR을 사용하고 회복 시 BID(bis in die, 하루 2회)를 최소 24시간 동안 사용하는 것이 좋습니다.
3. 수술용 클리퍼로 수염을 깎습니다. 이어바와 코 클램프를 사용하여 마우스와 신생아 쥐 어댑터에 마우스를 고정합니다.
   메모: 이 단계에서 마우스 머리가 고정되어 있고 나란히 움직이지 않는지 확인하는 것이 중요합니다.
4. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 수의사 연고를 눈에 바르십시오.

2. 가이드 캐뉼라 이식을 위한 입체 수술

1. 마우스와 신생아 쥐 어댑터를 정위 장치에 설정합니다. 메스를 사용하여 두개골 위의 피부를 수형으로 절개합니다. 젖은 면봉을 사용하여 두개골의 혈액과 결합 조직을 닦아냅니다.
2. brain atlas를 사용하여 관심 있는 뇌 영역에 대한 좌표를 결정합니다. 측정을 시작하기 전에 드릴 비트가 P로 이동하고 전체 시간 동안 정중선 봉합사에 남아 있을 수 있도록 정중선이 직선인지 확인하십시오.
   메모: 이 기사에서는 좌표(A/P: -3.1mm, M/L: -2.5mm, D/V: -1.2mm, 12도)를 사용하여 후방 해마를 대상으로 합니다.
3. 레벨 스컬 A-P
   1. 입체 프레임의 매니퓰레이터에 드릴을 부착합니다. 드릴이 람다에 부드럽게 닿을 때까지 드릴을 내리고 복부 좌표를 기록합니다. bregma.
      에 대해 이 절차를 반복합니다. 메모: 두개골이 수평을 이루면 브레그마의 수직 측정은 람다의 수직 측정과 같습니다. 그렇지 않은 경우 코 cl의 높이를 조정하십시오.amp 그에 따라. 두개골이 수평을 이룬 후 브레그마의 전방/후방, 측면 좌표를 기록합니다.
4. 레벨 두개골 왼쪽-오른쪽
   1. 드릴을 브레그마에서 좌표(전후 [A/P]: -3.1mm, 중간 [M/L]: +2.0mm)로 이동하고 드릴을 두개골까지 낮추고 수직 좌표를 기록합니다. 그런 다음 좌표(A/P: -3.1mm, M/L: -2.0mm)에 대해 이 절차를 반복합니다.
      메모: 두개골이 수평을 이루면 정중선에서 두 등거리 지점의 이러한 수직 측정은 동일합니다. 그렇지 않은 경우 이어바의 높이를 조정하십시오.
5. 가이드 캐뉼러를 이식하기 위해 목표 좌표(A/P: -3.1mm, M/L: -2.5mm)로 버 구멍을 조심스럽게 뚫습니다. 버 구멍의 직경이 가이드 캐뉼라 이식에 충분히 크지 않은 경우 첫 번째 구멍과 겹치는 다른 구멍을 뚫습니다. 오른쪽(반대쪽 쪽) 두정골에 또 다른 구멍을 뚫고 뼈 나사를 삽입하면 1.10에서 치과용 시멘트를 고정하는 데 도움이 됩니다(그림 1B 참조).
6. 면도날로 1.5mL 원심분리기 튜브 뚜껑 뒷면의 원형 잠금 부분을 자르고 "크라운"을 만듭니다. 이 크라운은 치과 시멘트가 피부에 퍼지는 것을 방지하는 데 사용됩니다. 2.5단계에서 만든 버 구멍이 원 안에 유지되도록 두개골에 놓습니다(그림 1 참조).
7. 입체 어댑터의 짧은 암에 가이드 캐뉼러를 놓고 캡 너트를 사용하여 고정하여 입체 어셈블리를 설정합니다. 전극 cl에 stereotaxic adapter의 더 긴 암을 설정합니다.amp. 입체 장치의 매니퓰레이터에 부착합니다(그림 1A 참조).
8. 매니퓰레이터 암의 D-V(dorsal-ventral) 스테레오택스 어셈블리를 12도 회전합니다(그림 1B 참조). 가이드 캐뉼러를 1.6에서 만든 버 구멍으로 이동합니다. 가이드 캐뉼러를 1.2mm 낮추어 천천히 뇌에 삽입합니다.
   메모: 프로브의 각도는 해마에 따라 다릅니다. 다른 지역에서는 다른 각도가 필요하거나 각도가 전혀 필요하지 않을 수 있습니다. 정확한 좌표를 위해 뇌 지도(brain atlas)를 참조하라. 그렇지 않으면 시멘트가 달라붙지 않고 시멘트 캡이 벗겨질 수 있으므로 두개골 표면을 말리십시오.
9. 크라운 내부에 치과용 시멘트를 추가하여 가이드 캐뉼라의 금속 부분과 뼈 나사를 모두 고정할 수 있을 만큼 충분히 덮습니다. 두개골의 일부가 노출된 경우 치과용 시멘트를 추가로 바르십시오.
10. 치과 용 시멘트가 완전히 마를 때까지 기다립니다 (~ 12-20 분). 전극 cl에서 입체식 어댑터를 제거합니다.amp. 캡 너트를 제거하고 입체택시 어댑터를 더미 프로브로 교체하고 캡 너트를 고정합니다.
11. 입체 장치에서 마우스를 해제하고 마우스를 개별 케이지에 단독으로 수용합니다.
    메모: 쥐는 흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 방치해서는 안 됩니다. 미세 투석 당일까지 매일 마우스를 확인하십시오. 쥐는 통증이 있는 것으로 보이는 경우 카프로펜과 같은 비스테로이드성 항염증제(NSAID)를 투여받습니다. 수면-각성 연구에는 마우스가 새로운 환경에 익숙해지도록 2주를 기다려야 하지만 다른 유형의 연구에는 더 짧은 회복 기간(예: 1-2일)이 필요할 수 있습니다.

3. 미세투석 설정

1. 프로브의 품질 검사: 일회용 1ml 주사기에 증류수를 채우고 바이톤 튜브를 사용하여 프로브의 배출구(짧은 포트)에 연결합니다. 통풍구를 손가락으로 막고 주사기 플런저를 부드럽게 눌러 프로브에 물을 주입합니다. 프로브 입구에서 물이 나오고 미세 투석막 표면에 누출이 없는지 확인하십시오.
   1. 프로브 활성화: 프로브의 멤브레인을 에탄올(70-100%)에 2초 동안 담그십시오. 그런 다음 주사기로 증류수를 프로브에 다시 주입합니다.
2. 관류 완충액의 준비: 표적 분자가 튜브에 부착되는 것을 방지하기 위해 CSF의 전해질 농도와 밀접하게 일치하는 인공 뇌척수액(aCSF: 1.3 mM CaCl₂, 1.2 mM MgSO₄, 3 mM KCl, 0.4 mM KH₂PO₄, 25 mM NaHCO₃, 122 mM NaCl, pH=7.35)으로 30% BSA 용액을 4%로 희석하여 BSA를 첨가합니다. 사용 직전에. 공극 크기가 0.1μm인 주사기 필터 장치를 통해 관류 완충액을 필터링합니다.
   참고: 4% 소 혈청 알부민(BSA)은 달라붙는 단백질의 회복을 향상시키지만 특히 BSA 결합이 높은 화합물의 경우 화합물의 전달을 심각하게 제한할 수 있습니다. 이는 특정 경우에 더 낮은 농도의 BSA(예: 0.15%)를 사용하는 것의 한 가지 이점입니다. BSA는 와류 또는 교반 플레이트에 의해 교반될 때 매우 쉽게 응집될 수 있습니다. 이러한 응집체는 프로브나 멤브레인 기공을 막을 수 있습니다. 이 응집을 제한하기 위해 BSA 용액을 준비할 때 주의하십시오
3. 입구와 출구를 위한 두 개의 별도 라인을 준비하고(그림 1C 참조) 두 라인을 연결 바늘로 연결합니다. 관류 완충액으로 채워진 일회용 3mL 주사기를 채우고 뭉툭한 바늘을 사용하여 튜브의 입구 끝에 연결합니다. 주사기 펌프를 실행하여 전체 튜브를 관류 버퍼로 채웁니다.
4. 주사기 펌프를 중지하고 입구 라인과 출구 라인 사이의 연결 바늘을 3.3단계의 활성화된 미세 투석 프로브로 교체합니다(그림 1C 참조). 교체하기 전에 프로브에 캡 너트를 끼우십시오.
5. 롤러 펌프의 배출 튜브에 롤러 튜브를 장착합니다. 주사기 펌프를 10μL/분으로 시작한 다음 롤러 펌프를 약간 느린 유속(9.5-9.8μL/분)으로 시작합니다. 프로브에 들어갈 때 복구에 영향을 줄 수 있는 전체 튜브의 모든 기포를 제거해야 합니다.
6. 1.12단계와 동일한 방법으로 1.2단계부터 마우스를 마취합니다. 마우스 칼라를 목에 두르십시오. 캡 너트와 더미 프로브를 제거하고 가이드 캐뉼러를 통해 3.4의 미세 투석 프로브를 천천히 삽입하고 캡 너트를 조입니다.
7. 자유롭게 움직이는 시스템에 연결된 케이지에 마우스를 놓고 칼라로 마우스를 묶습니다. 주사기 펌프와 롤러 펌프를 모두 3.5단계에서 표시된 유량으로 최소 1시간 동안 계속 가동
   메모: 깨어 있는 동물로부터 ISF를 수집하기 위해 이 기사에서는 케이지 자체가 동물의 움직임에 반응하여 튜브가 뒤틀리지 않도록 하는 자유 이동 시스템을 사용합니다. 또는 다양한 회사에서 제공하는 액체 스위블도 사용할 수 있습니다.
8. 먼저 롤러 펌프를 멈춘 다음 주사기 펌프를 멈춥니다. 원하는 유량을 설정합니다. 롤러 펌프보다 20% 더 빠르게 실린지 펌프를 가동합니다.
   메모: 예를 들어, 1μL/분으로 실행하는 경우 주사기 펌프를 1.2μL/분으로 작동하십시오. 최적의 유속은 각 분자에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다.
9. ISF 시료 채취: 배출 튜브의 자유단을 냉장 분획 수집기에 놓습니다.
   메모: 적절한 시료량은 분석에 사용된 분석법에 따라 다릅니다.
10. 실험 완료 후 프로브를 제거합니다. (필요에 따라 마우스를 마취합니다.)2.11단계와 동일한 방법으로 마우스 복구를 처리합니다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)과 같은 방법으로 수집된 ISF를 분석합니다.
11. 미세 투석 후 전체 튜브를 세척하려면 프로브를 연결 바늘로 교체하여 입구와 출구 튜브를 다시 연결하고 전체 튜브에 희석된 표백제를 실행한 다음 물로 씻어냅니다. 반복 사용을 위해 건조하고 보관하십시오 .
    메모: 다른 유형의 튜브도 허용되지만 관류 버퍼의 BSA는 직경이 작은 튜브를 막을 수 있으므로 이러한 튜브는 일회용으로 간주됩니다. 튜브는 여러 번 사용하면 마모되거나 막힐 수 있으므로 사용하기 전에 매번 유속이 일정한지 확인하십시오.

결과

그림 1: 수술 설정 및 미세 투석 회로의 구성. (가) 캡 너트, 입체 어댑터 및 가이드 캐뉼러를 사용하여 가이드 이식을 위한 입체 어셈블리를 설정합니다. (나) 가이드 캐뉼라를 이식하는 정위 수술. 가이드 캐뉼러는 수직에 대해 12도에서 뇌에 삽입됩니다. (C) 입구 튜브 및 출구 튜브의 구성. 입구 라인은 70cm FEP 튜브(JF-70)로 구성되고 출구 라인은 JF-70과 롤러 튜브 및 FEP 튜브의 1/2로 구성됩니다. 연결 바늘은 각 연결에 사용됩니다. (디) 전체 튜브가 관류 완충액으로 채워지면 펌프를 중지하고 주입 라인과 배출 라인 사이의 연결 바늘을 활성화된 미세 투석 프로브로 교체합니다. 입구 튜브의 끝을...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Univentor 820 마이크로샘플러	대학	8303002	냉장 분획 분취기
주사기 펌프	KD 사이언티픽	KDS-101
롤러 펌프	Eicom 미세투석	ERP-10
Raturn 독립 실행형 시스템	베이스	MD-1409	자유 이동 시스템
이중 종 케이지 키트	베이스	CX-1600
AtmosLM 미세투석 프로브(샤프트 길이 8mm, 멤브레인 길이 2mm)	Eicom 미세투석	PEP-8-02	프로브, 가이드, dumy 프로브 및 입체식 어댑터의 샤프트 길이는 동일해야 합니다.
미세투석 가이드 (샤프트 길이 8 mm)	에이콤 미세투석	페그-8
미세투석 더미 프로브 (샤프트 길이 8mm)	Eicom 미세투석	PED-8
뼈 나사	베이스	MD-1310
슈퍼 본드 C&B 세트	선메디컬		치과용 시멘트
디지털 디스플레이 콘솔이 있는 소형 동물 입체 기기	코프	모델 940	입체 장치
마우스 및 신생아 쥐 어댑터	도둑질	51625
마우스 입체택시를 위한 표준 이어바 및 고무 팁	도둑질	51648
소 혈청의 알부민 용액	시그마	A7284-50ML	30% BSA 솔루션
FEP 튜브(70cm)	에이컴 미세투석	JF-10-70	내부 부피 = 0.5 μL/cm
테프론 튜브(50cm)	에이컴 미세투석	JT-10-50	내부 부피 = 0.08 μL/cm
바이톤 튜브	Eicom 미세투석	JB-30
인트라메딕 루어 찌르기 어댑터 23G	BD	427565	무딘 끝 바늘
롤러 튜브	Eicom 미세투석	RT-5S	내부 부피 = 4 μL
캡 너트	에이컴 미세투석	교류-5
캡이 있는 0.25mL 마이크로 원심분리기 튜브	가격 변동	503-Q	분획 분취기용 튜브
스테로택시 어댑터(샤프트 길이 8mm)	Eicom 미세투석	페그-8
연결 바늘	에이컴 미세투석	RTJ
쥐 동물 목걸이	베이스	MD-1365
고속 로터리 마이크로모터 키트	포돔	K.1070	드릴
픽트로톡신	시그마	P1675
뼈 나사용 스크루 드라이버
메스
면봉
수술용 클리퍼