Microglia Glioblastoma Co-Culture를 사용한 매트릭스 기반 종양 침입 모델

초록

출처: Coniglio, S., et al. 교모세포종 침입의 대식세포 및 미세아교세포 자극을 연구하기 위한 공동 배양 분석. J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오에서는 교모세포종과 미세아교세포를 고분자 매트릭스 용액과 혼합하여 다공성 챔버 삽입물로 옮겨 겔이 형성되어 세포를 포매합니다. 미세아교세포는 다공성 삽입물을 통한 교모세포종 세포의 이동을 자극하여 종양 세포가 주변 조직으로의 침입을 모방하고, 세포를 고정하고 추가 분석을 위해 준비합니다.

프로토콜

1. 세포의 형광 표지

참고: 교모세포종 세포주와 미세아교세포를 형광 염료로 표시하십시오 9. 또는 GFP/RFP와 같은 형광 단백질을 구성적으로 발현하는 세포주를 생성합니다.

1. 6웰 플레이트의 플레이트 셀은 염색 당일에 70 - 80% 합류합니다. 쥐 교모세포종 세포주 GL261 및 인간 교모세포종 세포주 U87의 경우, 염색 24시간 전에 6cm 접시에 각각 1 x 10⁶ 및 1.5 x 10⁶ 세포를 플레이트합니다.
2. DMSO(Dimethyl sulfoxide)에서 형광 세포 염색 염료 용액을 준비하고 Roswell Park Memorial Institute 배지(RPMI) 또는 대식세포 혈청 무함유 배지(MSFM)의 와류 웰 배지에 5μM 염료를 첨가합니다.
3. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 30 분 동안 염료로 세포를 배양합니다.
4. 염료를 함유한 배지를 제거하고 세포에 새로운 배지(RPMI 또는 MSFM)를 추가합니다.
5. 30분 동안 세포를 배양합니다. 참고: 이제 세포가 염색되어 실험에 사용할 준비가 되었습니다.

2. Invasion Assay "3D"-embedding Glioma and Macrophage/Microglia를 매트릭스에

1. 매트릭스 혼합물을 4°C에서 밤새 해동합니다. 후드의 얼음 위에 매트릭스를 사용하여 모든 추가 조작을 수행합니다.
2. 얼음 위에서 0.3% BSA를 사용하여 배지(MSFM 또는 RPMI)에서 10mg/ml 농도의 매트릭스를 준비합니다.
   메모: 매트릭스의 스톡 농도는 일반적으로 약 15mg/ml입니다.
3. 매트릭스에서 현탁액을 위해 세포(1단계에서 라벨링됨)를 준비하려면 흡인에 의해 세포에서 배지를 제거합니다. 2mM EDTA(에틸렌디아민 테트라아세트산)/PBS(인산염 완충 식염수)가 담긴 접시에서 세포를 세척합니다. 500 μl의 2 mM EDTA/PBS를 세포에 첨가하고 37 °C 및 5% CO₂에서 5 - 10분 동안 배양합니다.
4. 0.3% BSA를 함유한 5ml의 배지에 세포를 재현탁합니다.
5. 120 x g에서 5분간 원심분리기
.
6. 펠릿에서 상등액을 흡입합니다. 세포의 농도가 1 x 10⁶ cells/ml와 같도록 media/0.3% BSA에 펠렛을 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.
7. 1.5 x 10⁵ GL261 세포(150μl) + 5 x 10⁴ microglia 세포(50μl)를 1.5ml microfuge 튜브에 추가합니다. 2 x 10⁵ GL261 셀(200μl)을 별도의 1.5ml 마이크로fuge 튜브에 추가합니다.
   메모: 미세아교세포가 없는 GL261 세포만으로도 대조군 역할을 합니다.
8. 마이크로퓨지에서 120 x g에서 5분 동안 세포를 회전시킵니다.
9. 얼음 위에서 200μl의 차가운 매트릭스로 세포를 재현탁합니다.
10. 50μl(50,000개 셀)를 8μM 공극 크기 챔버 인서트의 상단 구획 중앙에 플레이트합니다.
11. 중합이 일어나도록 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
12. 200 μl의 무혈청 배지를 상부 챔버에 추가하고 700 μl의 혈청 함유 세포 성장 배지를 하부 웰에 추가합니다.
13. 37 ° C, 5 % CO₂에서 48 시간 동안 배양합니다.
14. 배양 후 부드러운 흡인으로 챔버 상단에서 세포를 제거하고 PBS의 3.7% 포름알데히드에 넣어 챔버를 고정합니다. 챔버를 실온에서 15분 동안(또는 4°C에서 하룻밤) 고착 상태로 유지합니다. 부드러운 흡인으로 정착액을 제거하고 500μl 1x PBS로 교체합니다. 이미지 분석을 위해 섹션 4로 진행합니다.

결과

그림 1: 미세아교세포/대식세포 자극 교모세포종 세포 침입을 분석하기 위한 두 가지 프로토콜의 개략도. 상단 패널은 사전 코팅된 매트릭스 챔버 침습 분석을 보여줍니다. 하단 패널은 3D 매트릭스 침입 분석을 보여줍니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
코닝 BioCoat Matrigel Invasion Chamber: BD Matrigel Matrix 포함	코닝/피셔 사이언티픽	고양이: 354481
대식세포 혈청 프리 미디어(MSFM) (500ml)	생명공학과	12065-074
CellTracker 레드 CMTPX 염료	생명 기술/분자 프로브	C34552
CellTracker 그린 CMFDA 염료	생명 기술/분자 프로브	C2925
GL261 세포주	미국 국립암연구소(NCI)
THP-1 세포주	미국 조직 유형 배양 컬렉션	ATCC TIB-202
RPMI 1640 미디엄 (500 ml)	라이프 테크놀로지스/Gibco	11875-093
포름알데히드 용액	시그마 알드리치	F1635
Corning Transwell 폴리카보네이트 멤브레인 세포 배양 삽입물(8μM 공극) 팩당 48개.	코닝	CLS3422
Cultrex 3-D 배양 매트릭스 감소 성장 인자 기저막 추출물, PathClear	트레비겐	3445-005-01
송아지 태아 혈청 (FBS)	생명 기술	고양이: 10500064
소 혈청 알부민, 분획 V, 열 충격 처리	피셔사이언티픽	BP1600-100
0.5M EDTA	써모피셔 사이언티픽	15575-020