미세혈관 내피 세포 단층을 통한 림프구 전이 연구

초록

출처: Schulte-Mecklenbeck, A., et al., 인간 혈액-뇌 장벽의 체외 모델을 사용한 림프구 유출 분석. J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오는 혈액뇌장벽(BBB) 내피 모델을 통한 림프구 이식에 대한 실험적 조사를 보여줍니다. 인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMEC)의 단층을 in vitro에서 생성하고, 림프구를 포함하는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단층에 추가합니다. 그런 다음 세포를 배양하여 림프구 형질전환이 가능하도록 하고, 이동된 세포는 유세포 분석을 사용하여 정량화합니다.

프로토콜

1. 세포 배양 삽입물의 준비

1. 세포 배양 삽입물 코팅
   중요 참고 사항: 세포 배양 삽입물의 멤브레인을 만지지 마십시오.
   1. 각 세포 배양 삽입물(그림 1A)과 96웰 평면 바닥 플레이트(광학 제어 웰)의 1웰에 100μL 피브로넥틴 용액을 추가합니다. 37 °C에서 최소 3 시간 동안 배양하십시오. 배양 후 피브로넥틴 용액을 흡입합니다.
   2. 100μL HBMEC 현탁액을 세포 배양 삽입물과 광학 제어 웰에 추가합니다. 600μl 내피 세포 매체 기저(ECM-b) 배지를 세포 배양 삽입물의 하부 구획에 추가합니다. 장벽 무결성(그림 1B)에 도달할 때까지 37°C / 5% CO₂에서 3-4일 동안 배양하고 광학 제어 웰에서 HBMEC의 현미경 평가를 통해 세포 성장을 확인합니다.
      참고: 4일 이상의 세포 성장은 권장하지 않습니다.

2. 이동 분석

1. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 준비.
   1. 15mL 원심분리 튜브에 10mL Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 배지를 추가하고 200μL B27 보충제를 추가합니다. PBMC 및 원심분리 셀을 300 x g에서 5분 동안 계수합니다. PBMC를 5 x 10⁶ cells/mL RPMI/B27의 최종 농도로 재현탁합니다.
2. Migration Assay의 설정
   1. 하부 격실에서 배지를 흡인한 다음 융합 HBMEC 단층을 포함하는 세포 배양 삽입물의 상부 격실로 흡인합니다(그림 1A). 공여자당 세포 배양 삽입물에 각각 100μL PBMC 현탁액을 추가하고 (in vitro 대조군)당 24웰 플레이트의 한 웰에도 추가합니다.
   2. 세포 배양 삽입물의 하부 격실에 600 μL RPMI/B27을 추가하고 in vitro control의 PBMC에 500 μL를 추가하고 37 °C / 5% CO_{2에서 6시간 동안 배양합니다.}
3. 마이그레이션된 PBMC의 수확
   1. 겸자를 사용하여 세포 배양 삽입물을 꺼내고 멤브레인을 건드리지 않고 400μL 인산염 완충 식염수(PBS)로 바닥을 조심스럽게 헹굽니다. 세포 배양 삽입물을 폐기합니다.
   2. 세포 배양 삽입물의 하부 구획과 in vitro 대조군에 20μL 유동 수, 형구(약 1,000 beads/μL)를 추가하고 잘 혼합합니다. 생성된 PBMC 현탁액 1mL를 유세포 분석 튜브로 옮깁니다.

위치

3. 유세포 분석

1. 시료 전처리
   1. PBMC 원심분리기, 실온에서 300 x g, 5분간 사용.
   2. 샘플당 100μL 유세포 분석 완충액(PBS/1% 소 혈청 알부민[BSA]/2mM 에틸렌디아민테트라아세트산[EDTA])에 플루오로크롬 접합 항체를 추가하여 항체 용액을 준비합니다. 아래에 제시된 결과의 경우 샘플당 1 μL CD4-FITC(클러스터 분화 4-플루오레세인 이소티오시아네이트), 1 μL CD3-PerCP/Cy5.5(페리디닌 엽록소 단백질/시아닌 5. 5), 1 μL CD56-PC7(피코에리트린 시아닌 7), 1 μL CD8-A700(Alexa fluor 700) 및 1 μL CD16-A750(Alexa fluor 750)을 사용했습니다.
   3. PBMC를 100μL의 항체 용액에 다시 현탁시키고 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
   4. 250 μL 유세포 분석 완충액을 추가하고 300 x g에서 5분 동안 원심분리를 합니다.

결과

그림 1: 불연성 HBMEC 단층과 불연성 HBMEC 단층을 가로지르는 NK 세포 부분집합의 차등 이동. ᅡ.트랜스웰 인서트 사진(왼쪽)과 실험 설정 그림(오른쪽).B. HBMEC 배리어 기능 검증. 왼쪽: 3일 동안 배양한 HBMEC에서 토끼 항-인간 zonula occludens-1 (ZO-1, abcam, 1:200) 및 염소 항토끼 면역글로불린 G/cyanine 3 (IgG-Cy3, 1:300)을 사용하여 밀접연접 분자 ZO-1의 면역조직화학적 염색. 중앙: 배양 2일차와 4일차 사이에 HBMEC의 경내피 전기 저항(TEER). 오른쪽: 24시간 동안 500 U/mL 인터페론 감마(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)로 자극이 있거나("염증이 없는", 검은색) HBMEC...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PBS (PBS)	지브코	제14190-094	CaCl2 또는 MgCl2 없음
피브로넥틴 1mg/mL	시그마	F1141-5MG	소 플라즈마에서
HBMEC (하이브멕)	사이엔셀	1000
HBMEC (하이브멕)	펠로바이오텍	PB-H-6023
ECM-비	사이엔셀	1001-비
FBS(증권 시세	사이엔셀	1001-비
페니실린/스트렙토마이신	사이엔셀	1001-비
내피 세포 성장 보충제	사이엔셀	1001-비
트랜스웰	코 닝	3472	투명, 직경 6.5mm, 기공 크기 3.0μm
96웰 플랫 바텀 플레이트	코 닝	3596
나27	지브코	제17504-044	50배 농축
48웰 플레이트	코 닝	3526
RPMI 1640	지브코	우편번호 61870-010
Flow Count Fluorospheres (플로 카운트 형광구)	벡크만 쿨터	7547053
나-EDTA	시그마	E5134
증권 시세	시그마	A2153
CD3-PerCP/Cy5.5	바이오레전드	300430	클론 UCHT1
CD56-PC7	벡크만 쿨터	A21692	클론 N901
CD16-A750	벡크만 쿨터	A66330	클론 3G8
CD4-핏씨	바이오레전드	300506	클론 RPA-T4
CD8-A700	벡크만 쿨터	A66332	클론 B9.11