중대뇌동맥 폐색 후 쥐 뇌에서 경색 영역과 뇌 부종 측정(Measuring the Infarct Zone and Brain Edema in a Rat Brain Following Middle Cerebral Artery Occlusion)

초록

출처: Frank, D., et al. Measuring post-stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Destruction in a single set of 설치류 뇌 샘플에서. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 중대뇌동맥 폐색을 받은 쥐의 뇌 절편에서 경색 영역과 뇌 부종을 평가하는 방법을 보여줍니다. 경색 부위는 산화 환원 염색을 사용하여 식별되며, 이미지 분석 소프트웨어의 블루 필터 및 임계값 기능은 영향을 받은 반구의 경색 영역과 부종을 정량화합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 경색 부위 측정

1. 중대뇌동맥폐색(MCAO) 후 24시간에 경색 영역(IZ)을 측정합니다.
   메모: 체중이 20% 이상 감소하거나 발작 또는 편마비가 발생한 쥐는 실험에서 제외됩니다.
2. 쥐가 자발적으로 호흡을 멈출 때까지 흡기 가스 혼합물을 20% 산소와 80% 이산화탄소로 대체하여 쥐를 안락사시킵니다.
3. 가위와 수술용 집게를 사용하여 흉곽 아래 복벽을 통해 5-6cm 측면 절개로 가슴을 엽니다.
4. 가위와 수술용 집게로 흉곽 전체를 따라 횡격막 절개를 수행합니다.
5. 조심스럽게 폐를 옮겨 흉곽을 통해 오른쪽과 왼쪽의 쇄골까지 자릅니다.
6. 심장의 좌심을 통해 200mL의 생리식염수를 관류합니다.
7. 가위로 심장의 오른쪽 심방을 뚫거나 절개합니다.
8. 단두대를 사용하여 참수를 수행하고 뇌 조직을 채취합니다.
9. 홍채 가위를 사용하여 구멍(foramen magnum)에서 양쪽 뒤쪽 두개골 표면의 원위 가장자리까지 자릅니다.
10. 두개골의 복부 표면과 등쪽 표면을 따라 있는 후각구(olfactory bulbs), 신경 연결을 뇌에서 분리합니다.
11. 머리에서 뇌를 제거한다.
12. .009" 스테인리스강, 코팅되지 않은, 단면 면도날로 2mm 두께의 수평 단면을 만들어 6개의 뇌 절편을 생성합니다.
13. 37°C에서 0.05% TTC로 30분 동안 배양합니다.
14. 뇌 조직을 현미경 슬라이드에 놓고 1600x1600dpi의 해상도로 6개의 뇌 절편을 광학 스캔합니다(예: 그림 1 참조).
15. 채널 믹서 기능(이미지 > 조정 > 채널 믹서)을 사용하여 사진 편집기(예: Adobe Photoshop CS2)로 파란색 필터를 추가하고 이미지를 JPEG 파일 형식으로 저장합니다.
    >메모: 파란색 필터를 적용하면 이미지가 회색조로 나타납니다.
16. ImageJ 1.37v.
    에서 저장된 이미지를 엽니다. 메모: 이 컴퓨터 프로그램은 임계값 함수를 사용하여 검은색 또는 흰색 픽셀을 분리하고 계산합니다(그림 2 참조).
17. 이미지의 6개 뇌 절편 각각에 대해 각 반구(오른쪽 손상된 동측 및 왼쪽 부상하지 않은 반대쪽 측면)를 선택하고 메인 메뉴의 "다각형 선택" 도구를 사용하여 별도의 이미지 파일로 저장합니다.
18. ImageJ 소프트웨어의 메인 메뉴에서 Image > Adjust the Threshold를 선택하여 자동 임계값 기능을 사용하여 IZ를 결정하기 위한 컷오프> 설정하고 단일 브레인 세트의 각 반구에 있는 픽셀 수를 측정합니다.
    >메모: ImageJ 소프트웨어에서 이 단계에 매크로를 사용할 수 있습니다(코드는 보충 문서 1 참조). 컷오프는 회색 음영에 따라 어떤 픽셀을 흰색으로 변환하고 어떤 픽셀을 검은색으로 변환할지 결정하는 데 중요한 매개변수입니다(예: 그림 3 및 그림 4 참조). 그런 다음 ImageJ는 흰색 픽셀과 검은색 픽셀을 비교하여 IZ를 결정합니다. 염색 프로토콜과 스캐너 설정에 따라 0.220의 일정한 컷오프 값을 사용했습니다.
19. RICH(Ratios of Ipsilateral and Contralateral Cerebral Hemispheres) 방법(그림 5의 예 참조)을 사용하여 조직 부종에 대한 IZ 교정 측정을 수행합니다.
    
    메모: 경색 크기는 반대쪽 반구의 백분율로 평가됩니다.

2. 뇌부종의 판정

참고: 뇌부종(BE) 측정을 위해 ImageJ 1.37v를 사용하십시오.

1. MCAO 24시간 후에 BE를 측정합니다. BE를 계산하려면 왼쪽 및 오른쪽 반구 부피(단위)의 데이터를 사용합니다.
2. 1600x1600dpi의 해상도로 광학 스캔을 수행합니다(예: 그림 1 참조).
3. 뇌 반구를 선택하고 위의 섹션 1.17-1.19에서 설명한 대로 ImageJ 1.37v로 BE를 결정하기 위한 컷오프를 설정합니다.
4. BE 영역을 영향을 받지 않는 반대쪽 반구의 표준 영역에 대한 백분율로 표현하고, 다음 방정식(그림 5의 예 참조)을 사용하여 RICH 방법으로 계산합니다.
   
   메모: BE의 범위는 반대쪽 반구의 백분율로 평가됩니다.

결과

그림 1: 뇌 절편 스캔 예시.

그림 2: 가짜 작동 쥐와 MCAO 쥐의 대표적인 뇌 절편.

(A-B) 원본 스캔 이미지. (C-D) 그레이스케일로 변환. (예) 임계값 함수. (지-H) 블루 필터 적용. (나-제이) 블루 필터 적용 후 임계값 기능. (K-L) 뇌부종을 평가하기 위해 역치 기능 사용.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
뇌 및 조직 매트릭스	시그마-알드리치	15013
광학 스캐너	캐논	카노 스캔 4200F	해상도 3200 x 6400dpi
페트리 접시	시그마-알드리치	P5606
메스 블레이드 #11	시그마-알드리치	S2771
소프트웨어
Windows용 Adobe Photoshop CS2	아도비
이미지J 1.37v	국립보건원		소스 코드는 무료로 사용할 수 있습니다. 저자 웨인 래스번드(Wayne Rasband, wayne@codon.nih.gov)는 미국 메릴랜드주 베데스다에 있는 국립정신건강연구소(National Institute of Mental Health)의 연구 서비스 분과(Research Services Branch)에 있습니다
오피스 365 프로플러스	마이크로소프트	-	마이크로소프트 오피스 엑셀
윈도우 10	마이크로소프트
시약
2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드	시그마-알드리치	298-96-4
에반스 블루 2%	시그마-알드리치	314-13-6