In Vitro Blood-Brain barrier 모델에서 경내피 전기 저항 평가

초록

출처: Kuzmanov, I., et al. 임피던스 분광법을 사용한 혈액-뇌 장벽의 시험관 모델: T 세포-내피 세포 상호 작용에 초점. J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 in vitro에서 마우스 뇌 미세혈관 내피 세포에서 경내피 전기 저항(TEER)을 평가하는 방법을 보여줍니다. TEER 값이 높으면 내피 세포 접합이 손상되지 않았음을 나타내고, 활성화된 T 세포가 추가되면 TEER 값이 낮아져 접합 장벽의 파괴를 반영합니다.

프로토콜

1. 경내피 전기 저항(TEER) 측정 설정 및 수행

1. 경내피 전기 저항(TEER) 기기의 24웰 모듈을 층류 후드 아래에 놓습니다. 뚜껑을 제거하고 집게를 사용하여 기기에 기본 마우스 뇌 미세혈관 내피 세포(MBMEC)가 있는 삽입물을 놓습니다.
2. 모듈 웰의 하단 구획에 810 μl의 새로운 배지를 피펫 : 인서트와 모듈 웰의 벽 사이에 조심스럽게 추가하십시오.
3. 뚜껑을 닫고 기구를 인큐베이터에 넣습니다. 기기를 컴퓨터에 연결하십시오. 기기 컨트롤러를 켜고 소프트웨어를 엽니다.
4. 팝업 창에서 '새 측정'을 선택합니다. 'show TEER' 및 'show Ccl' 상자를 선택합니다. 그런 다음 '시작'을 누릅니다.첫 번째 측정을 완료한 후 '결과' 탭에서 '모든 웰 확인'을 선택하여 모든 TEER 및 셀층 커패시턴스(Ccl) 값을 확인합니다.
5. 파일 저장: 파일>다른 이름으로 저장>' 파일 이름'.
   참고: TEER와 Ccl은 자동화된 방식으로 지속적으로 측정되므로 3일에서 5일 동안 값을 모니터링합니다. TEER의 증가 부족으로 시각화된 바와 같이 세포 생존율이 최적이 아닌 한 배지를 변경할 필요가 없습니다.
6. Ccl이 안정적이고 1μF/cm² 미만이며 TEER이 최대 수준에 도달했을 때 T 세포와 MBMEC를 공동 배양할 시점을 선택합니다.
7. 절대 TEER 및 Ccl 값을 주의 깊게 검사하고 MBMEC가 이러한 웰의 검사를 취소하여 충분히 융합된 단층이 형성되지 않은 웰을 제외합니다.
8. 나머지 우물 그룹화: 우물을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 '새 평균 유정에 우물 추가'를 선택합니다. 팝업 창에서 이름을 지정하십시오. 그룹화할 모든 개별 웰에 대해 동일한 작업을 수행합니다.
9. 모든 평균 웰을 확인하여 모든 웰이 공동 배양 전에 동일한 초기 조건을 갖는지 확인합니다. 일부 항목의 절대 TEER 값 또는 TEER 기울기가 현저히 다르거나 표준 오차가 너무 큰 경우 그룹화를 다시 실행합니다.
   참고: 최적의 우물 그룹화는 실험 그룹 내에서 그리고 실험 그룹 간의 TEER 값의 변동을 최소화합니다.
10. '실험' 탭에서 '일시 중지'를 누르고 기기를 분리한 다음 인큐베이터에서 꺼냅니다. 층류 후드 아래의 뚜껑을 제거합니다.
11. 필요에 따라 특정 사이토카인, 항체 또는 기타 물질의 유무에 관계없이 사전 활성화된 및/또는 미접촉 T 세포를 준비합니다. 예를 들어, 정제된 네이티브/저 내독소(NA/LE) 랫트 안티 마우스 인터페론 감마(IFN-γ) 항체(클론 XGM1.2)를 준비된 T 세포와 TEER 기기의 웰당 20μg/ml로 혼합합니다.
    참고: 그랜자임 B 억제제와 같은 물질을 사용하는 경우, T 세포 자극 시작 시 T 세포 배양에 추가됩니다: 예: , Granzyme B Inhibitor II(Calbiochem)는 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 10μM의 최종 농도로 분리된 T 세포와 혼합됩니다.
12. 인서트(상단 웰 구획)에서 일부 매체를 제거합니다. 예: 150μl를 조심스럽게 피펫으로 빼냅니다(MBMEC 단층을 방해할 수 있으므로 모든 매체를 제거하지 않아야 함).
13. 삽입당 2 x 10⁵ 세포를 포함하는 배지 150μl를 조심스럽게 피펫팅하여 MBMEC에 T 세포를 추가합니다.
    참고: 사전 활성화된 T 세포를 수확할 때는 Trypan Blue가 없는 발파 세포만 세십시오.
14. 뚜껑을 닫고 기구를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 기기를 다시 연결하고 '측정 재개'를 누릅니다. 24시간 후 '실험' 탭에서 '중지'를 누르고 파일(파일>저장)을 저장합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
셀Z스코프	나노애널리틱스	www.nanoanalytics.com	포함: 24웰 셀 모듈, 컨트롤러, cellZscope 소프트웨어 v2.2.2
트랜스웰 멤브레인 인서트 - 기공 크기 0.4 μm	코닝	3470	TEER 측정을 주요 판독값으로 사용
Transwell 멤브레인 인서트 - 기공 크기 3 μm	코닝	3472
24웰 세포 배양 플레이트	그라이너	650 180	평평한 바닥; MBMEC 문화용
96웰 세포 배양 플레이트	코스타	3526	둥근 바닥; 면역세포 배양용
노이바우어 계수실	마리엔펠트	MF-0640010
인간 태반에서 추출한 콜라겐 IV형	시그마	C5533
소 혈장에서 추출한 피브로넥틴	시그마	F1141-5MG
DMEM (+ 글루타맥스)	기코	31966-021
페니실린/스트렙토마이신	시그마	P4333
헤파린	시그마	H3393
인간 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)	페프로텍	100-18B
IMDM + 1% L-글루타민	기코	21980-032
재조합 쥐 IFN-γ	페프로텍	315-05
재조합 쥐 TNF-α	페프로텍	315-01A
NA/LE 정제 항마우스 IFN-γ 항체	BD 바이오사이언스	554408	클론 XMG1.2; 권장 최종 농도: 20 μg/ml
그란자임 B 억제제 II	칼비오켐	368055	권장 최종 농도: 10 μM
PE anti-mouse CD4 항체	바이오레전드	116005	클론 RM4-4; T 세포 형질전환 분석
트리판 블루 솔루션, 0.4%	써모 피셔 사이언티픽	15250061

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