마우스 뇌의 Meyner의 핵 기저부에서 신경 섬유의 면역조직화학적 염색

초록

출처: Singh, P., et al. Stereological Estimation of cholinergic fiber length in the nucleus basalis of Meynert of the Mouse Brain(마우스 뇌의 Meynert의 핵 기저부에서 콜린성 섬유 길이의 입체학적 추정). J. Vis. 특급. (2020)

이 비디오는 마우스 뇌 절편의 Meynert 영역의 핵 기저부에 있는 콜린성 섬유의 면역조직화학적 염색을 보여줍니다. 절편을 차단하고 콜린 아세틸전이효소에 대한 1차 투여한 후 비오틴화된 2차 항체를 투여합니다. Avidin-biotin-peroxidase 복합체가 추가되어 2차 항체에 결합한 다음 발색 기질에 결합합니다. 그런 다음 단면을 탈수하고 장착한 후 현미경으로 시각화합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 관류 및 조직 처리

1. 케타민(100mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)을 복강내 주사하여 마우스를 마취합니다. 계속하기 전에 반응이 없는지 확인하기 위해 발가락을 꼬집습니다.
2. 얼음처럼 차가운 0.1M Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) ~50mL를 심 관통한 다음 0.1M 인산염 완충액(PB)에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 투여합니다.
   주의: PFA는 독성이 있습니다. PFA로 작업할 때는 개인 보호 장비(PPE)를 사용하십시오.
3. 뇌를 제거하고 고정 후 24시간 동안 4°C에서 0.1M PB의 4% PFA에 담그십시오. DPBS 3x로 세척합니다.
4. 하룻밤 동안 0.1 DPBS에서 15 % 자당 용액으로 변경 한 다음 4 ° C에서 48 시간 동안 0.1 M DPBS에서 30 % 자당 용액으로 변경합니다.
5. 자당 용액에서 조직을 제거하고 -20 °C의 온도로 사전 설정된 극저온 챔버에서 동결합니다. 냉동 샘플은 절편화될 때까지 -80 °C의 밀봉된 튜브에 보관할 수 있습니다.
6. 최적의 절단 온도 포매 매체(재료 표 참조)에 조직을 삽입하고 시편 디스크에 장착합니다. 냉동 저장체를 사용하여 관상동맥 평면에서 30μm 두께의 연속적인 절편을 절단하고 결과적으로 동결 보호 용액(30% 글리세롤, 30% 에틸렌 글리콜, 40% DPBS; 그림 1A–C). -20 °C 냉동고에 보관하십시오 .
   참고: 가능하면 더 두꺼운 섹션(예: 50μm)이 선호됩니다. 섹션이 절단 순서로 유지되고 모든 섹션이 완전히 동결 보호제에 있는지 확인하십시오. 96웰 플레이트는 24웰 플레이트의 대안으로 사용하여 섹션을 수집할 수 있습니다.
7. 증발과 건조를 방지하기 위해 플레이트 실러로 웰을 덮으십시오. 나중에 사용할 때까지 플레이트를 -20 °C에서 보관하십시오. -20 °C에서 보관된 절편은 콜린 아세틸전이효소(ChAT) 면역조직화학을 위해 몇 달 동안 안정적입니다.

2. IHC를 위한 체계적인 섹션 선택

참고: 허용 가능한 오류 계수(CE)를 달성하는 데 필요한 총 섹션 수를 알기 위해 파일럿 연구를 수행해야 합니다. CE 값은 샘플링 절차의 총 오차량을 표현한 것입니다. 가장 낮은 값은 최소 오류를 나타내며, 0.1보다 낮은 CE 값은 여기에 사용된 소프트웨어에서 허용 가능한 것으로 간주됩니다(재료 표 참조).

1. 형태학적 특징을 Franklin 및 Paxinos와 같은 표준 마우스 뇌 지도와 비교하여 각 뇌의 첫 번째 섹션과 마지막 섹션을 식별합니다. Meynert 또는 NBM의 핵 기저부는 브레그마 -0.0mm에서 시작하여 -1.6mm에서 끝납니다. 따라서 약 50개의 섹션이 NBM을 포함합니다. 총 섹션 수는 stereology에서 필요한 매개 변수 중 하나입니다. 모든 8^번째 섹션(SSF = 1/8)을 선택하면 분석을 위해 총 6-7개의 섹션이 제공되었으며 파일럿 연구에서 부피 추정 및 섬유 길이 추정 모두에 대해 허용 가능한 CE를 산출했습니다.
2. 처음 8개 절편 중 하나부터 무작위로 시작한 다음 NBM을 포함하는 마지막 사후 절편까지 8^번째 절편마다 전신 샘플링합니다(그림 1C).

3. 면역조직화학

1. 동결 보존된 절편을 동결 보호제에 넣어 실온으로 옮긴 다음 0.1M 인산염 완충액(PB)을 6웰 플레이트에 넣습니다.
2. PB로 3번 세탁합니다.
3. 메탄올에 0.3% H₂O₂ 에서 15분 동안 배양합니다.
4. 트리스 완충 식염수(TBS)로 3번 세척합니다.
5. TBS에서 0.25% Triton X-100을 30분 동안 배양합니다.
6. TBS 중 0.1% Triton X-100 중 10% 일반 소 혈청(NBS)으로 30분 동안 차단합니다.
7. 4°C에서 48시간 동안 0.1% Triton X-100 및 1% NBS를 사용하여 TBS에서 염소 항인간 ChAT 1차 항체(재료 표 참조)를 1:1,000 희석하여 배양합니다.
8. 실온에서 TBS로 3번 세탁하십시오. 실온에서 모든 추가 배양 및 세척을 수행합니다.
9. 비오틴화된 소 항염소 2차 항체(재료 표 참조)를 1시간 동안 배양합니다.
10. TBS에서 3번 세탁합니다.
11. avidin-biotin-peroxidase 복합체로 배양합니다(Table of Materials 참조).
12. TBS에서 3번 세탁합니다.
13. 제조업체의 권장 사항에 따라 향상된 DAB 과산화효소 기질 용액(재료 표 참조)을 사용하여 개발합니다.
    주의: DAB는 발암 의심 물질입니다. 접촉 및 흡입에 의해 독성이 있음. DAB로 작업할 때 PPE를 사용하십시오.
14. 증류수로 섹션을 몇 번 씻고 Tris pH = 7.6으로 유지합니다.
15. 젤라틴 슬라이드에 섹션을 장착합니다. 한 조직의 모든 섹션을 동일한 슬라이드에 넣을 수 있습니다. 섹션을 자연 건조하고 70%, 90%, 95% 및 100% 에탄올로 각각 5분 동안 2회 탈수한 다음 10분 크실렌 세척 2회로 섹션을 청소합니다. 장착 매체를 사용하여 섹션을 커버슬립합니다(재료 표 참조).
    알림: 탈수 및 제거의 처리 시간은 섹션의 두께에 영향을 미칩니다. 따라서 모든 섹션에 동일한 조건을 사용해야 합니다. 본 연구에서 최종 두께의 평균값은 21.11 ± 0.45 μm였다.
16. 흄 후드의 섹션을 건조하게 유지하십시오. 건조한 부분은 stereology를 위해 준비되어 있습니다.

결과

그림 1: 본 연구에 사용된 조직 처리 및 샘플링의 그림. 샘플 준비 및 샘플링. (A) 소뇌와 후각구는 표본 디스크에 장착하기 전에 제거됩니다.(B) 단면 절단을 위한 표본 디스크에서 뇌의 방향. 한쪽 반구에 있는 얕은 세로 절개(선으로 표시)는 단면에서 뇌의 측면을 식별하는 데 도움이 됩니다. (C) 24웰 플레이트에서 모든 8번째 섹션('X'로 표시)의 체계적인 선택을 보여주는 24웰 플레이트의 개략도. (D) 체계적으로 선택된 6개 섹션에서 NBM의 경계를 구분하는 코로나 단면의 개략도. (예) ChAT에 대해 면역 염색된 코로나 절편의 대표 이미지 및 NBM의 위치(개요). (H) NBM 경계를 보여주는 고배율 이미지. LV = 외측심실; VL = 복측 시상핵(ventrolateral thalamic n...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ABC 키트	벡터 연구소	PK6100
항ChAT 항체	미국 매사추세츠주 밀리포어	AB144P
소 안티 염소 IgG-B	산타크루스 생명공학	사우스캐롤라이나-2347
소 혈청, 성인	시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	B9433
극저온 조절기	Lieca Microsystems, 미국 일리노이주 버팔로 그로브
둘베코의 인산염 완충 식염수	시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	D5652
에틸렌 글리콜	시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	324558
글리세롤	시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	G2025
과산화수소	시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	H1009
Immpact-DAB 키트	벡터 연구소	SK4105	향상된 DAB 과산화효소 기질 용액
케타민	Westward Pharmaceuticals, 뉴저지, 미국	0143-9509-01
현미경	Lieca Microsystems, 미국 일리노이주 버팔로 그로브	AF6000	전동 무대 및 IMI-tech 컬러 디지털 카메라 장착
최적 절삭 온도(O.C.T.) 임베딩 매체	전자 현미경 과학, 펜실베니아, 미국	62550-12
파라포름알데히드	시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	P6148
퍼마운트 마운팅 미디어	전자 현미경 과학, 펜실베니아, 미국	17986-01
트리톤 X-100	시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	T8787
트리즈마 베이스	시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	T1503	트리스 베이스
트리즈마 염산염	시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	T5941	트리스 염산염
자일라진	바이엘, 레버쿠젠, 독일	롬푼
크실렌, 조직학적 등급	시그마-알드리치, 세인트루이스, MO	534056