방사성 표지된 도파민을 사용하여 마우스 뇌 시냅토솜에서 도파민 흡수 측정

초록

출처: Jensen, K. L., et al., 고성능 액체 크로마토그래피 분석 및 시냅토솜 도파민 흡수를 사용한 마우스의 도파민 항상성 평가. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 쥐의 뇌에서 채취한 시냅토솜의 도파민 흡수 평가를 보여줍니다. 도파민 수송체를 통한 도파민 흡수를 위해 시냅토솜을 준비하고, 다양한 농도의 방사성 표지된 도파민으로 처리하고, 시냅토솜을 분리하고, 도파민 흡수를 정량화하기 위해 방사능을 측정하는 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

1. 시냅토솜 도파민 흡수

참고: 이 프로토콜은 두 개의 뇌를 병렬로 평가하기 위한 것이지만 4개의 뇌를 병렬로 사용하여 시냅토솜 도파민(DA) 흡수 실험을 수행하는 데에도 성공적으로 사용할 수 있습니다.

1. 준비
   1. 표 1에 따라 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브 48개(각 뇌당 24개)에 라벨을 부착합니다. 각 뇌에 속한 튜브에 다른 색상을 사용하여 샘플 간의 혼동을 방지합니다.
   2. 라벨 51 섬광 튜브 # 1-51.
   3. 얼음 위에 인산염 완충 식염수(PBS)를 놓습니다. 이것은 뇌를 차갑게 유지하는 데 사용됩니다.
   4. 원심분리기를 켜서 4°C로 예냉각되도록 합니다.
   5. 시냅토솜 준비 중에 정확한 조직 무게를 얻기 위해 두 개의 마이크로 원심분리 튜브의 무게를 미리 측정합니다(섹션 2.6).
   6. 4mM HEPES와 0.32M 자당을 혼합하여 균질화 완충액을 준비합니다. pH를 7.4로 조정하고 얼음에 보관하십시오.
      메모: 균질화 완충액은 -20°C의 부분 표본에 보관하고 실험 당일에 해동할 수 있습니다.
   7. 25mM HEPES, 120mM NaCl, 5mM KCl, 1.2mM CaCl₂, 1.2mM MgSO₄, 1mM 아스코르브산(0.194g/L), 5mM D-글루코스(0.991g/L)를 결합하여 흡수 버퍼를 준비합니다. NaOH로 pH를 7.4로 조정하고(약 130mM의 나트륨 농도로 이어짐) 얼음에 보관하십시오.
      메모: 2개의 뇌의 경우 1500mL 흡수 버퍼를 준비합니다. 흡수 완충액을 4 °C로 유지되지 않는 아스코르브산과 포도당이 없는 10x 스톡 용액으로 준비합니다. 당일에 1x 작업 용액을 새로 만들고 아스코르브산과 포도당을 보충합니다. NaOH로 pH를 7.4로 조정합니다.
   8. 다음을 결합하여 흡수 완충액 + 리간드를 준비합니다: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM CaCl₂, 1.2 mM MgSO₄, 1 mM 아스코르브산(0.194 g/L), 5 mM D-글루코스(0.991 g/L), 1 μM 파길린, 100 nM 데시프라민, 10 nM 카테콜-O-메틸-전이효소(COMT) 억제제. NaOH로 pH 7.4로 조정하고 얼음에 보관하십시오.
      메모: 50mL 흡수 완충액을 사용하고 리간드를 추가합니다. 파질린(Pargyline)은 모노아민 산화효소(MAO)를 통한 산화에 의한 DA의 분해를 방지하기 위해 첨가됩니다. COMT 억제제(RO-41-0960)를 첨가하여 COMT를 통한 DA(일반적으로 카테콜아민)의 분해를 방지합니다. 노르에피네프린 및 세로토닌 수송체를 통한 흡수를 억제하기 위해 데시프라민이 첨가되어 도파민 수송체(DAT)에 특이적인 흡수 결과를 만듭니다.
   9. 다음을 결합하여 흡수 완충액 + 리간드 + 코카인(coc)을 준비합니다: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM CaCl₂, 1.2 mM MgSO₄, 1 mM 아스코르브산(0.194 g/L), 5 mM D-글루코오스(0.991 g/L), 1 μM 파르길린, 100 nM 데시프라민, 10 nM COMT 억제제, 500 μM 코카인. NaOH로 pH를 7.4로 조정하고 얼음에 보관하십시오.
      메모: 7mL 흡수 완충액 + 리간드를 사용하고 코카인을 첨가합니다. 데이터에서 빼기 위해 비특이적 DA 흡수의 배경 측정을 얻기 위해 코카인을 첨가하고 DAT 특이적 흡수만 남깁니다(위에서 설명한 바와 같이 SERT와 NET은 데시프라민에 의해 억제되기 때문에). 또는 매우 강력하고 특이적인 DAT 억제제인 GBR-12935를 대신 사용할 수 있습니다.
      중요: 이제부터 모든 것을 얼음 위에 두십시오.
2. 시냅토솜 제제
   1. 한 번에 한 마리의 쥐를 경추 탈구와 참수로 희생하십시오.
   2. 가위로 피부를 잘라 두개골을 드러내고 참수한 후 두개골 뒤쪽에 남아 있는 여분의 조직을 잘라냅니다. 시지봉선을 따라 작은 곧은 가위로 두개골을 자르고 가능한 한 앞쪽으로 끝냅니다.
   3. 마우스의 양쪽 눈에 두 개의 가위 끝을 놓고 두개골을 잘라 두개골의 나머지 부분과 손상되지 않은 뇌를 제거합니다. 뇌를 빠르게 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS에 넣습니다. 이렇게 하면 두 번째 뇌가 해부되는 동안 차갑게 유지될 것입니다.
   4. 뇌 매트릭스를 사용하여 선조체의 3mm 관상 절편(전방-후: +1.5mm에서 -1.5mm)을 해부한 다음 펀처로 더 미세하게 해부합니다. 펀치 영역에 대해서는 그림 1을 참조하십시오.
   5. 티슈는 항상 얼음 위에 올려 놓으십시오.
   6. 조직을 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 무게를 측정합니다.
      메모: 이 가중치는 1.2.14단계에서 사용됩니다.
   7. 두 번째 브레인에 대해 1.2.1-1.2.6단계를 반복합니다.
   8. 두 뇌의 무게를 구한 후 조직을 1mL의 얼음처럼 차가운 균질화 완충액이 들어 있는 균질화 유리로 옮깁니다.
   9. 800rpm, 10번의 스트로크에서 모터 구동 유봉을 사용하여 조직을 균질화합니다.
      메모: 한 번의 스트로크는 한 번의 위아래 동작과 같습니다. 첫 번째 스트로크는 약 5초, 다음 3-4초여야 합니다. 등장성 매질에서의 균질화는 시냅토솜의 파열을 방지하는 데 중요합니다. 적절한 힘과 등장성 매질을 사용하면 시냅스전 말단이 세포질, 시냅스 소포, 미토콘드리아 및 세포골격을 둘러싸고 있는 것을 다시 밀봉할 수 있습니다.
   10. 균질액을 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 0.5mL의 추가 균질화 완충액으로 헹궈 균질화 유리에서 나머지 균질액을 수집합니다.
   11. 다른 뇌의 조직이 균질화되는 동안 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 1.2.12-1.2.13 단계에서 두 브레인을 병렬로 실행합니다.
   12. 핵과 세포 파편을 원심분리(1,000 x g, 10분, 4°C)로 펠렛
   화합니다.
   13. 상층액(S1)(세포막과 세포질 포함)을 새로운 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브와 16,000 x g의 원심분리기로 4°C에서 20분 동안 옮깁니다.
   14. 상등액(세포질 함유)을 버리고 펠릿(P2)(미처리 시냅토솜 함유)을 40μL 균질화 완충액/mg 조직(1.2.6단계에서 얻은 중량 기준)에 재현탁합니다. 너무 많은 힘을 가하면 시냅토솜이 파손될 수 있으므로 p1000 피펫으로 조잡한 시냅토솜 분획을 부드럽게 재현탁합니다.
       메모: 최소 280μL로 끝나는 것이 중요합니다. 그렇지 않은 경우 mg당 40μL 이상으로 희석해야 합니다. 1.2.1-1.2.13 단계는 가능한 한 빨리 수행해야하며 모든 것을 얼음 위에 보관해야합니다. 조잡한 시냅토솜이 균질화 완충액에 재현탁되자마자 얼음 위에 보관되는 한 상당히 안정적입니다.

2. 흡수 실험

1. 지정된 12개의 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 440μL 흡수 버퍼 + 리간드 + 코카인을 추가하고 나머지 36개의 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 440μL 흡수 버퍼 + 리간드를 추가합니다(레이아웃은 표 1 참조).
   메모: 실험 시작 15분 전에 얼음에서 꺼내 실온에 두되 억제제를 보존하기 위해 그때까지 얼음에 보관하십시오.
2. 다양한 최종 농도(0.031, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 및 1.0 μM))에서 포화 곡선(도파민(2, 5, 6-[3H]-DA)(3-H 도파민)(91.1 Ci/mmol))을 준비합니다.
   1. 6개의 2mL 마이크로 원심분리기 튜브를 10, 5, 2.5, 1.25, 0.62 및 0.31로 표시합니다.
   2. 750μL 흡수 버퍼 + 리간드를 가장 낮은 숫자의 5개의 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다.
   3. 1,455.4 μL 흡수 버퍼 + 리간드, 14.6 μL 도파민(1 mM), 30 μl 3-H 도파민(11 μM)을 10이라고 표시된 튜브에 추가합니다.
   4. 10으로 표시된 튜브에서 5로 표시된 튜브로 750μL를 전달합니다. 잘 섞어 이 튜브에서 2.5 튜브로 750μL를 옮깁니다. 나머지 튜브에 대해 이 희석을 반복합니다.
3. 유리 극세사 필터를 4웰 필터 버킷에 놓은 후 12mL 흡수 버퍼로 미리 헹굽니다.
4. 440μL 완충액을 포함하는 첫 번째 24개의 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브(레이아웃은 표 1 참조)에 10μL의 시냅토솜 멤브레인 현탁액을 추가합니다. 조심스럽게 소용돌이치고 시냅토솜이 완충액에 잠기도록 잠시 동안 회전합니다. 37^°C에서 10분 동안 방치합니다.
   메모: 뇌 간의 공정한 비교를 위해 흡수 실험 중 시간을 정확하게 파악하는 것이 중요합니다. 정확성을 위해 스톱워치를 사용하십시오.
5. 농도 10 및 5 μM(섹션 2.2)의 도파민 50μL를 처음 두 개의 열에 추가하고 진탕과 함께 5분 동안 37^°C로 둡니다. 정확히 5분 후 1mL의 얼음-저온 흡수 버퍼를 추가하여 반응을 중지합니다. 농도 2.5 및 1.25μM(섹션 2.2)로 동일한 작업을 수행한 다음 농도 0.62 및 0.31μM로 동일한 작업을 수행합니다.
6. 미리 헹궈진 극세사 필터에 샘플을 추가하고 5 x 4 mL의 얼음처럼 차가운 흡수 버퍼로 세척합니다. 처음 12개의 샘플이 필터에 추가되면 필터를 섬광 튜브로 이동합니다. 다음 12개 샘플에 대해 이 작업을 반복합니다.
7. 다음 브레인에 대해 2.4-2.6단계를 반복합니다.
8. 섬광 튜브 49-51의 바닥에 극세사 필터를 배치하고 상단에 최대 도파민 농도 25μL(10μM)를 추가하여 3개의 최대 계수 튜브를 준비합니다.
9. 51개의 섬광관을 모두 흄 후드에 1시간 동안 그대로 둡니다.
10. 각 섬광 튜브에 3mL의 섬광 플루이드를 넣고 쉐이커에서 1시간 동안 세게 흔듭니다.
11. 베타 카운터에서 1분 동안 [³H]-DA를 셉니다.
    1. 프로그램을 열고 선택: 라벨: H-3, 플레이트/필터: 4 mL 바이알, 4 x 6, 분석 유형: 정상 및 계수 시간: 1분
       메모: 이 단계는 더 편리한 경우 다음 날에 수행할 수 있습니다. 샘플을 은박지로 덮은 샘플을 밤새 그대로 두십시오.
12. 단백질 측정
    1. 표준 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 분당 카운트(cpm)에서 fmol/min/μg으로 조정하고 샘플 간 흡수를 적절하게 비교하기 위해 시냅토솜의 단백질 농도를 측정할
    수 있습니다.

3. 데이터 분석

1. 흡수 실험의 데이터를 사용하여 각 그룹에 대한 채도 곡선을 만들고 반응 속도(V_max)와 Michaelis Menten 상수(K,_M)를 계산합니다.
   메모: K_M 값은 V_max의 절반에 도달하는 데 필요한 기판 농도를 반영합니다. 따라서 V_max는 DAT(최대 흡수 용량)의 기능을 직접 반영하며, 이는 표면의 DAT 수와 그 활성이 번역 후 변형 및/또는 상호 작용 단백질에 의해 어떻게 조절될 수 있는지, 그리고 이온 구배의 변형에 따라 달라집니다. K_M 값은 수송체에 대한 기질 친화도의 간접적인 측정이며, 중요하게는 번역 후 변형 및/또는 상호 작용하는 단백질에 의해 조절될 수도 있습니다. 따라서 기능적 변화를 완전히 평가하려면 예를 들어 표면 비오틴화(surface) 비오틴화(biotinylation) 분석을 통해 표면 발현 수준을 직접 측정하는 것이 중요합니다.

표 1: 시냅토솜 준비를 위한 마이크로 원심분리기 튜브 레이아웃.

분 개 호 호 분 개 호 호 분 개 호 호

10	5	2.5	1.25	0.62	0.31
10	5	2.5	1.25	0.62	0.31
10	5	2.5	1.25	0.62	0.31
10+코씨	5+코크	2.5+코크	1.25+콕	0.62+코씨	0.31+코씨

결과

그림 1: 시냅토솜 DA 흡수 실험 프로토콜의 여러 단계를 보여주는 개략적인 워크플로우. 쥐는 경추 탈구에 의해 희생되고, 그 다음에는 뇌 해부와 뇌 매트릭스에 배치됩니다. 3mm 두께의 관상 절편을 뇌에서 절개하고, 뇌량 바로 아래의 작은 부위를 양측 펀치로 미세하게 해부합니다. 등쪽 선조체는 기계적 파괴에 의해 1mL 균질화 완충액에서 균질화된 후 저속으로 10분 동안 원심분리합니다. 상등액을 깨끗한 튜브로 옮기고 20분 동안 고속으로 원심분리합니다. 시냅토솜을 포함하는 펠릿은 재현탁되어 흡수 실험을 위해 준비됩니다. 흡수는 최종 농도 0.031에서 1μM에 이르는 서로 다른 [³H]-DA 농도의 3배를 추가하여 수행됩니다. 또한, 다양한 농도의 트리티화 DA를 500μM 코카인을 함유한...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
COMT 억제제	시그마 알드리치, 독일	RO-41-0960	synaptosomal DA 흡수 프로토콜의 경우
[3H]-도파민	Perkin-Elmer Life Sciences, 미국 매사추세츠주 보스턴	NET67-3001MC	synaptosomal DA 흡수 프로토콜의 경우
유리 극세사 필터	GF/C Whatman, GE 헬스케어 생명과학, 버킹엄셔	1822-024	시냅토솜 DA 흡수 프로토콜의 경우
HiSafe 섬광액	퍼킨 엘머	1200-437	synaptosomal DA 흡수 프로토콜의 경우
마이크로베타2	퍼킨 엘머		시냅토솜 DA 흡수 프로토콜의 경우
BCA 단백질 분석 키트	써모 사이언티픽 피어스	23225	synaptosomal DA 흡수 프로토콜의 경우
헵스	시그마 생명과학	H3375	시냅토솜 DA 흡수 프로토콜의 경우
설탕	시그마 생명과학	S7903	시냅토솜 DA 흡수 프로토콜의 경우
염화나트륨	시그마 생명과학	S3014	시냅토솜 DA 흡수 프로토콜의 경우
KCl	시그마 생명과학	P9541	시냅토솜 DA 흡수 프로토콜의 경우
염화나트륨2	머크 KGaA	10043-52-4	synaptosomal DA 흡수 프로토콜의 경우
마그네슘SO4	시그마 생명과학	63065	시냅토솜 DA 흡수 프로토콜의 경우
아스코르브산	시그마 생명과학	A0278	시냅토솜 DA 흡수 프로토콜의 경우
D-포도당	시그마 생명과학	G7021	시냅토솜 DA 흡수 프로토콜의 경우
파길린	시그마 알드리치	P-8013	synaptosomal DA 흡수 프로토콜의 경우
데시프라민	시그마 알드리치	D3900	synaptosomal DA 흡수 프로토콜의 경우
도파민	시그마 생명과학	H8502	synaptosomal DA 흡수 프로토콜의 경우
코카인	시그마 생명과학	C5776	시냅토솜 DA 흡수 프로토콜의 경우
뇌 매트릭스	ASI 기기	RBM2000C	시냅토솜 DA 흡수 프로토콜의 경우
카파노 기계식 테프론 파괴자	부흐 & 홀름	제품 생산 중단	시냅토솜 DA 흡수 프로토콜(균질화)의 경우