시각화를 위한 쥐 해마 절편에서 바이오사이틴으로 채워진 중간뉴런 라벨링

초록

출처: Economides, G., et al. Biocytin Recovery and 3D Reconstructions of Filled Hippocampal CA2 interneurons. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 바이오사이틴으로 채워진 중간뉴런을 포함하는 고정된 쥐의 뇌 절편을 염색하는 절차를 보여줍니다. 이 프로토콜에는 아비딘-비오틴 복합체(ABC)를 사용한 배양, HRP 및 발색 기질로 염색, 사산화오스뮴으로 구조 보존, 이미징을 위해 조직을 수지에 삽입하는 것이 포함됩니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회

에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 전기생리학적 기록 및 바이오사이틴 충전에 따른 인터뉴런 및 바이오사이틴 시각화의 칼슘 결합 단백질 또는 단백질 함량 측정

참고: 전기생리학적 기록이 끝날 때, 바이오사이틴으로 채워진 세포를 포함하는 절편은 조직학적 절차 전에 밤새 고정됩니다. 조직 손상을 방지하기 위해 나머지 절차를 다른 날에 수행하는 경우 다음 날 아침 고정 용액을 0.1M 인산염 완충액의 단일 교체로 교체합니다. 고정 용액(0.1M 인산염 완충액(PB)에 있는 4% 파라포름알데히드, 0.2% 포화 피크르산 용액, 0.025% 글루타르알데히드 용액)은 최상의 결과를 위해 기록 당일에 새로 만들어야 합니다.

1. 전기생리학적 기록이 끝나면 페인트 브러시로 기록된 세포가 들어 있는 절편을 조심스럽게 집어 인공 뇌척수액(ACSF)이 들어 있는 냄비에 넣습니다.
   참고: 날카로운 전극을 사용한 절편 준비 및 세포 내 기록에 사용되는 프로토콜에 대한 세부 정보는 이전에 설명되었습니다.
2. 흄 후드에서 붓으로 뇌 조각을 조심스럽게 집어 작은 고품질 여과지 조각에 굴립니다. 물에 적신 여과지 한 장을 슬라이스 위에 놓고 젖은 여과지 두 장을 5-10mL의 고정액이 담긴 작은 플라스틱 냄비에 넣고 4°C의 냉장고에서 하룻밤 동안 보관합니다.
3. 증류수에 젤라틴 용액을 준비합니다. 열판의 비커에 증류수 20mL를 넣고 60°C로 가열합니다. 젤라틴 2.4g을 물에 점진적으로 넣고 녹을 때까지 기다렸다가 조직 손상을 방지하기 위해 사용하기 전에 35-40°C로 식힙니다.
4. 정착 용액을 0.1M PB의 2mL로 교체합니다. 조각을 페트리 접시에 넣고 메스 날로 여분의 조직을 잘라냅니다. 트리밍된 조직을 페트리 접시(직경 9cm, 높이 1.4cm)에 넣고 접히거나 주름이 생기지 않고 평평하게 놓이도록 하고 마른 페인트 브러시를 사용하여 여분의 버퍼를 제거합니다.
5. 따뜻한 젤라틴 용액으로 조직을 덮고 페트리 접시를 얼린 블록에 올려 용액을 빠르게 식힙니다.
6. 콘트라스트를 만들기 위해 앵글 포이즈 램프를 사용하여 접시 옆면을 들여다보고 젤라틴이 굳기 시작할 때까지 고운 붓으로 가벼운 압력을 가하여 슬라이스를 평평하게 유지합니다.
   참고: 젤라틴은 조직이 평평하지 않으면 다시 녹을 수 있습니다. 젤라틴이 굳을 때 페인트 브러시를 제거하여 발생하는 젤라틴 표면의 결함은 램프의 전구를 몇 초 동안 표면 가까이로 이동하여 표면층을 부드럽게 녹여 제거할 수 있습니다.
7. 젤라틴을 굳힌 접시를 냉장고에 옮기고 4°C에서 30-60분 동안 그대로 둡니다.
8. 흄 후드에서 메스 블레이드를 사용하여 접시의 젤라틴 포함 조직이 포함된 작은 블록(~ 1 x 1cm)을 잘라내고 작은 주걱을 사용하여 블록을 들어 올린 다음 4°C에서 최소 30분 동안 조각을 고정하는 데 사용된 동일하지만 새로운 고정 용액에 조심스럽게 놓습니다.
9. 젤라틴 블록을 0.1M PB 5mL로 3회 세척하고 종이 티슈 한 장을 사용하여 건조시킨 다음 블록 면이 위로 향하게(즉, , 조직이 위에 오도록) 슈퍼 접착제를 사용하여 비브라톰 척에 붙입니다.
10. 여과지 조각으로 여분의 접착제를 제거하고 메스 날을 사용하여 블록의 모서리를 잘라내어 다이아몬드 모양을 남깁니다.
11. 비브라톰을 사용하여 50μm 두께로 슬라이스를 절단하고 10% 자당이 함유된 유리 바이알에 각 섹션을 조심스럽게 놓습니다.
12. 바이알에서 한 부분을 조심스럽게 집어 페트리 접시 뚜껑에 평평하게 놓습니다. 해부 현미경과 새 메스 칼날을 사용하여 절편 주변의 젤라틴을 제거하고 절편을 신선한 10% 자당 2mL
    가 들어 있는 바이알에 다시 넣습니다. 참고: 탈수 단계(1.37단계)에서 조직 수축을 줄이기 위해 이 단계에서 가능한 한 많은 젤라틴을 제거하는 것이 중요합니다.
13. 0.1M PB 기반 자당-글리세롤 용액의 절편을 실온에서 10% 자당 용액에서 10분, 20% 자당-6% 글리세롤 용액에서 2회 2회, 마지막으로 30% 자당-12% 글리세롤 용액에서 30분 동안 지속적으로 교반하여 2회 배양하여 극저온 보호합니다.
14. 붓을 사용하여 작은 직사각형의 은박지 위에 섹션을 평평하게 놓습니다. 섹션에서 과도한 액체를 제거하고 은박지를 소포에 조심스럽게 접습니다.
15. 30초 동안 표면을 건드리지 않고 소포를 액체 질소 표면 가까이에 들고 약 30초 동안 섹션이 완전히 해동되도록 합니다. 동결-해동을 두 번 더 반복합니다.
16. 붓으로 모든 부분을 제거하고 2mL의 0.1M PB가 들어 있는 유리 바이알에 넣고 지속적으로 교반하여 과도한 자당을 씻어냅니다.
17. 파스퇴르 피펫으로 PB를 제거하고 2mL의 1% 과산화수소 수성(H₂O₂)에 절편을 30분 동안 배양합니다. 0.1M PB 3x 5분 2mL로 절편을 세척합니다.
18. 파스퇴르 피펫으로 0.1M PB를 제거하고 0.1M PB에 1% 수소화붕소나트륨(NaBH₄)을 첨가합니다.
    참고: NaBH₄ 용액은 수소 가스를 방출하므로 바이알의 뚜껑을 닫지 마십시오.
19. 파스퇴르 피펫으로 수소화붕소나트륨을 제거하고 0.1M PB 5x 5분 2mL로 섹션을 철저히 세척합니다.
20. 0.1M PB에서 30분 동안 0.1M PB를 10% 일반 염소 혈청(NGS)으로 교체합니다.
21. 염소 혈청을 제거하고 ABC 용액으로 구성된 마우스 단클론 항체와 토끼 다클론 항체의 혼합물로 4 °C에서 밤새 섹션을 배양합니다.
    참고: 이전 연구에서 사용된 1차 항체 목록은 표 1에 나와 있습니다.
22. 어두운 곳에서 2시간 동안 형광 표지된 2차 항체의 혼합물에서 절편을 배양합니다(Table of Materials).
23. 장착 매체의 슬라이드에 섹션을 장착하고 커버 슬립으로 덮습니다.
24. 40X 배율로 형광 라벨링 이미지를 촬영합니다(그림 1Bb).
25. 형광 이미징 후 PBS가 들어 있는 유리 페트리 접시에 슬라이드를 넣고 커버슬립을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 파스퇴르 피펫에서 PBS의 부드러운 펄스를 사용하여 슬라이드에서 섹션을 씻어냅니다. PBS가 들어 있는 깨끗한 유리 바이알에 섹션을 놓습니다.
26. HRP 반응 생성물을 증폭하기 위해 먼저 ABC의 절편을 최소 2시간 동안 배양하여 avidin-HRP 반응을 수행합니다.
27. 증류수 5mL에 1정을 첨가하여 3,5 디아미노벤지딘(DAB) 용액을 준비합니다.
28. PBS로 10분 동안 세 번 섹션을 세척한 다음 Tris 버퍼로 10분 동안 두 번 두 번 세척합니다. 마지막 세척 후 Tris 버퍼를 제거하십시오.
29. 8 % NiCl₂ (염화니켈) 용액 한 방울을 DAB 용액에 빠르게 첨가하고, 용액을 피펫으로 주입 및 배출하여 혼합하고, 이 용액 1mL를 섹션에 빠르게 추가합니다. DAB/NiCl₂ 용액에서 15분 동안 섹션을 배양합니다.
30. 1% H₂O₂ 10μL를 DAB 용액에 추가합니다. 약 1-2분 동안 일정한 교반 하에서 암흑 속에서 반응을 진행하고 해부 현미경으로 채워진 세포의 라벨링을 모니터링합니다.
31. DAB/NiCl₂/H₂O₂ 용액을 제거하여 반응을 중지하고 Tris buffer로 섹션을 5분 동안 두 번 세척합니다.
32. 흄 후드에서 작은 원의 여과지를 페트리 접시에 넣고 0.1M PB로 적십니다. 붓을 사용하여 유리병에서 섹션을 한 번에 하나씩 들어 올려 종이 위에 조심스럽게 평평하게 놓습니다.
33. 물에 적신 또 다른 원의 여과지로 섹션을 덮고 티슈 페이퍼를 표면에 부드럽게 닿아 과도한 버퍼를 제거합니다.
34. 0.1M PB에 1% 사산화오스뮴 8-9방울을 상단 종이에 바르고 접시를 덮고 흄 후드에 최소 30분 동안 유지하지만 1시간 이하로 유지합니다.
35. 페트리 접시를 열고 상단 여과지를 들어 올립니다. 붓으로 한 번에 하나씩 조심스럽게 들어 올려 유리병에 넣고 증류수로 두 번 헹굽니다.
36. 사산화오스뮴 폐기물은 적절하게 폐기하십시오. 모든 일회용 장비를 헹구고 적절한 쓰레기통에 넣으십시오.
37. 각 섹션을 유리 슬라이드에 평평하게 놓고 섹션을 커버슬립합니다. 슬라이드를 페트리 접시에 옮기고 커버슬립 위에 빈 유리병을 올려 제자리에 고정한 다음 50% 알코올로 덮습니다. 15분 후 용액에서 슬라이드를 제거하고 슬라이드에서 섹션을 제거합니다. 섹션을 슬라이드에 다시 놓고 슬라이드를 70% 알코올에 15분 동안 놓습니다. 95% 알코올 용액으로 동일한 과정을 반복하고 마지막으로 100% 알코올 용액으로 합니다.
38. 탈수 단계에 따라 흄 후드의 셰이커에서 100% 알코올이 들어 있는 유리 바이알로 섹션을 옮깁니다. 알코올 용액을 프로필렌 옥사이드(C₃H₆O)로 교체하고 5분 동안 3회 세척합니다. 마지막 세척 후 바이알에 ~2mL의 프로필렌 옥사이드를 유지하고 수지(1:1 비율)를 추가합니다. 수지가 용해되었는지 확인하고 30분 동안 섹션을 지속적으로 교반합니다.
39. 나무 막대기를 사용하여 에폭시 수지가 들어있는 알루미늄 판자에 각 섹션을 넣고 밤새 배양합니다.
    참고: 단면이 손상될 위험을 피하기 위해 수지의 단면을 24시간 이상 방치하지 마십시오.
40. 플랑셰트를 핫 플레이트 위에 약 10분 동안 놓습니다. 나무 막대기로 각 부분을 집어 깨끗한 슬라이드에 올려 놓습니다. 해부 현미경을 사용하여 각 섹션의 방향을 일관되게 유지하십시오. 섹션 위에 커버슬립을 놓습니다. 경화를 위해 슬라이드를 48°C에서 56시간 동안 오븐에 넣습니다.

표 1: 솔루션 표.

사용된 솔루션	작곡/지침
정착 솔루션	4% 파라포름알데히드, 0.2% 포화 피크르산 용액, 0.1M 인산염 완충액(PB)의 0.025% 글루타르알데히드 용액
0.1M 인산염 완충액 pH 7.6	900mL의 증류수에 100mL의 스톡 1M 인산염 완충액 첨가
인산염 완충 식염수(PBS) pH 7.4/7.5	증류수 990mL에 0.1M 인산염 완충액 10mL, KCl 0.2g, NaCl 8.76g을 추가합니다
트리스 완충액 pH 7.5	5.72g의 Tris Hydrochloride와 1.66g의 Tris Base를 50mL의 증류수에 녹입니다. 그런 다음 증류수로 최대 1L를 만듭니다.
완충된 글루타르알데히드 및 파라포름알데히드 고정액	4% 파라포름알데히드, 0.2% 포화 피크르산 용액, 0.025% 글루타르알데히드 용액 0.1M 인산염 완충액.
ABC 솔루션	용액은 ABC 키트에서 사용하기 최소 30분 전에 만들어야 합니다. 용액 A 1방울과 용액 B 1방울을 PBS 2.5mL에 추가합니다.
Durcupan 에폭시 수지:	20개의 냄비 만들기: 성분 A 20g, 성분 B 20g, 성분 C 0.6g, 성분 D 0.4g-
	여과지로 플레이트를 덮어 저울이 엎질러지지 않도록 보호하십시오. 시약의 무게를 조심스럽게 측정하여 위에서 언급한 비율로 삼중 비커에 넣습니다. 두 개의 나무 막대기를 사용하여 최소 5분 동안 세게 저어 완전히 섞습니다. 혼합물은 균일 한 밀도의 짙은 갈색이되어야합니다. 비커를 ~50°C의 오븐에 최대 10분 동안 넣어 가능한 한 많은 기포를 제거합니다. 참고: 비커를 오븐에 10분 이상 방치하면 수지가 경화되기 시작합니다. 수지를 플라스틱 냄비 또는 5mL 주사기에 넣고 날짜를 기입한 다음 -20 °C 냉동고에 보관하여 바로 사용할 수 있습니다.

결과

그림 1: 해마 CA2 영역에 기록되고 채워진 두 가지 유형의 바구니 세포의 신경 재구성 및 세포 내 기록 체외 기록 후 얻은 상관 전기생리학적 데이터 . 이 수치는 이전 연구에서 수정된 것입니다. SO 지층 Oriens, SP 지층 Pyramidale, SR 지층 요골, SLM 지층 Lacunosum 분자. (A) Aa: 드로잉 튜브(1000X)를 사용하여 제한된 수지상 및 축삭 아버가 있는 CA2 바구니 세포의 재구성. 수상돌기는 검은색이고 축삭돌기는 빨간색입니다. Ab: 여기에 설명된 avidin-HRP 프로토콜에 따른 바이오사이틴으로 채워진 바스켓 세포의 이미지. Ac: 제한된 수지상 및 축삭 아버를 가진 CA2 바스켓 셀의 과...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) 항체- 20.8 mg/mL	벡터 연구실	A2008
바이오사이틴 ≥98% (TLC)	시그마	B4261
3,5 디아미노벤지딘(DAB) 정제, 5mL 준비	시그마	D4293
듀르쿠판 에폭시 수지 A	시그마	44611
Durcupan 에폭시 수지 B	시그마	44612
듀르쿠판 에폭시 수지 C	시그마	44613
Durcupan 에폭시 수지 D	시그마	44614
에탄올, 퓨리스. PA, 절대, ≥99.8%	시그마	32221
젤라틴	시그마	48723
글루타르알데히드 용액, 등급 I, H2O	시그마	G5882
글리세롤, ≥99%	시그마	G5516
염소 혈청	시그마	G9023
염소 항 마우스 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)- 14.3 mg/mL	시그마	F2653
염소 안티 토끼 텍사스 레드 (TR)- 3.3 mg/mL	인비트로젠	T2767
과산화수소, 30% 용액	시그마	H-1009
이멀젼 오일, 점도 1.250 cSt (lit.)	시그마	I0890
염화니켈	시그마	N5756
사산화오스뮴, 전자 현미경용, 물 중 4%	시그마	75632
파라포름알데히드, 시약 등급, 결정질	시그마	P6148
물에 적신 피크르산, ≥98%	시그마	197378
인산염 완충액 1 M	시그마	P3619
프로필렌 옥사이드, 99%	알파 에저	30765
소듐테트라하이드로보레이트	폭스바운드	27885.134
설탕	피셔 사이언티픽	S/8600/53
트리즈마 염산염, ≥99.0%	시그마	T5941
트리즈마 베이스, ≥99.9%	시그마	T6066
Vectashield 안티페이드 마운팅 미디엄, , 굴절률 1.45	벡터 실험실	H-1000
벡타스테인 엘리트 ABC HRP 키트	벡터 실험실	PK6100
사용 장비
비브라톰	한천 과학
C4A 컵형 알루미늄 플란체트	GA-MA & 어소시에이츠, INC.
라이카 DMR 현미경	라이카 마이크로시스템즈
X-Cite 120PC Q 형광 광원	엑셀리타스 테크놀로지스
라이카 DFC450 디지털 현미경 카메라	라이카 마이크로시스템즈
래피도그래프 테크니컬 드로잉 펜 0.18mm	런던 그래픽 센터
0.18mm 라피도그래프 펜촉	런던 그래픽 센터
래피도그래프 테크니컬 드로잉 펜 0.25mm	런던 그래픽 센터
0.25mm 라피도그래프 펜촉	런던 그래픽 센터
XYZ 무대 제어를 위한 PC 워크스테이션, 무대, 카메라 및 joystic을 포함한 Neurolucida 시스템	마이크로브리필드(MBF) 생명과학
Neurolucida 소프트웨어 버전 2017	마이크로브리필드(MBF) 생명과학
CorelDRAW 그래픽 제품군 X5	코렐
동영상 편집 소프트웨어	어도비 프리미어 프로
유리병 14 mL	피셔 사이언티픽

중 25% 위치