방사형 운동 분석법을 사용한 예쁜꼬마선충 모델의 운동 손상 평가

초록

출처: Currey, H. N., et al. 근위축성 측삭 경화증의 C. elegans 모델의 운동 장애 평가. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 야생형 또는 ALS 돌연변이 인간 TDP-43 단백질을 발현하는 예쁜꼬마선충의 운동 기능 장애를 평가하기 위해 방사형 운동 분석을 사용하는 방법을 보여줍니다. 다양한 수준의 야생형 또는 돌연변이 TDP-43 발현을 가진 웜은 크롤링할 수 있으며, 이들의 움직임은 분석 플레이트의 중심점에서 이동한 반경 거리로 측정됩니다. 이 분석은 다양한 예쁜꼬마선충 균주가 이동한 거리에 따라 경증, 중등도 및 중증 운동 장애를 구별합니다.

프로토콜

1. 방사형 운동 분석

1. 직경 100mm 또는 150mm의 페트리 접시를 준비하고, 선충 성장 매체(NGM)를 절반 정도 채우고 한천의 전체 표면을 덮기 위해 OP50 박테리아의 균일한 잔디밭을 파종합니다.
2. NGM 분석 플레이트를 거꾸로 뒤집고 바닥에 분석할 C. elegans 균주에 대한 식별자(균주당 2개 플레이트)를 표시합니다(그림 1A).
3. 거꾸로 된 플레이트의 중앙에 마커가 있는 작은 점을 만듭니다(그림 1A).
4. 해부 현미경으로 작업하는 동안 백금 와이어 픽을 사용하여 15-20개의 병기 일치하는 웜을 중앙 점(NGM을 통해 볼 수 있음) 바로 위의 분석 플레이트 중앙으로 전송합니다(그림 1B).
   메모: 모든 웜을 동시에 또는 가능한 한 빨리 전송하십시오.
   1. 웜을 플레이트 중앙에 놓은 후 30분 동안 타이머를 설정합니다. 접시에 뚜껑을 다시 놓고 따로 보관합니다(그림 1C).
5. 모든 균주가 지정된 분석 플레이트에 있을 때까지 웜을 계속 옮기고 플....

결과

그림 1: 방사형 보행 분석 워크플로우. 패널 A-E은 방사형 운동 분석의 일반화된 단계를 보여줍니다. 단계는 다음과 같습니다: (A) OP50이 가장자리에 시드된 NGM 플레이트는 중앙 점을 라벨링하고 표시하여 준비되며, (B) 웜은 중앙 점으로 표시된 한천 중앙에 배치되며, (C) 웜은 일정 시간 동안 자유롭게 이동할 수 있습니다. (D) 플레이트를 아래에서 위로 뒤집고 각 웜의 최종 위치를 중앙 점과 다른 색상으로 표시합니다.(E) 중앙 점에서 각 최종 웜 위치까지의 거리는 수동 또는 디지털 방식으로 측정됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C. 예쁜꼬마선	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	-	원하는 대로 균주를 획득하면 N2는 유용한 제어 변형률
일회용 파스퇴르 피펫, 붕규산 유리	폭스바운드	14673-010	웜 픽을 만드는 데 사용되는 유리 피펫 - 한 손에는 유리 피펫을 들고 다른 손에는 ~ 1 인치의 백금 와이어 (펜치로 잡음)를 화염 위에 올려 놓습니다.
일회용 페트리 접시, 35x10mm	폭스바운드기	10799-192	WormLab 이미징 시스템용 어세이 플레이트
일회용 페트리 접시, 60x15mm	폭스바운드기	25384-090	지렁이용 스톡 플레이트
일회용 페트리 접시, 100x15mm	폭스바운드기	25384-302	표준 방사형 이동 분석 플레이트
일회용 페트리 접시, 150x15mm	폭스바운드	25384-326	더 긴 시간 프레임의 방사형 이동 분석 플레이트
해부 현미경	라이카	M80	웜 유지 관리 및 방사형 운동 분석 설정 범위
끝이 세밀한 마커	폭스바운드	52877-810	방사형 이동 분석을 위해 최소 2가지 색상이 필요합니다. 정확성을 위해 미세한 팁이 필요합니다.
평판 스캐너	아마존	엡손 퍼펙션 V850	방사형 이동 분석에 선택 사항입니다. 프로토콜은 해상도가 300dpi라고 가정하면 대부분의 스캐너는 잘 작동합니다
NGM (선충 성장 배지)	폭스바운드	76347-412	C. elegans를 재배하는 데 사용되는 매체. 처음부터 만들 수 있습니다, WormBook: Maintenance of C. elegans
OP50 박테리아	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	예쁜꼬마선충의 주요 식량 공급원
P1000 피펫터	폭스바겐	76207-552	수영 분석에 사용되는 피펫터
p1000 팁	폭스바운드기	83007-384	수영 분석에 사용되는 피펫터 팁
백금 와이어, 직경 0.2032mm	폭스바운드기	BT136585-5M	웜 픽을 만드는 데 사용되는 미세 게이지 백금 와이어 - 한 손에는 유리 피펫을 잡고 다른 손에는 ~ 1 인치의 백금 와이어 (펜치로 잡기)를 화염 위에 올려 결합합니다.
통치자	폭스바운드기	56510-001	방사형 운동 분석에 점수를 매겨야 함
이미지J	국립보건원	-	에서 제공하는 선택적 무료 소프트웨어 국립보건원(NIH) - https://imagej.nih.gov/ij/
웜랩 이미징 시스템	MBF 바이오사이언스	웜랩	이미징 시스템에는 가 포함됩니다. WormLab 하드웨어 (명시야 무대, 카메라, 주택) 및 WormLab 소프트웨어. https:// www.mbfbioscience.com/wormlabimaging- 시스템

참조