방사형 운동 분석법을 사용한 예쁜꼬마선충 모델의 운동 손상 평가

초록

출처: Currey, H. N., et al. 근위축성 측삭 경화증의 C. elegans 모델의 운동 장애 평가. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 야생형 또는 ALS 돌연변이 인간 TDP-43 단백질을 발현하는 예쁜꼬마선충의 운동 기능 장애를 평가하기 위해 방사형 운동 분석을 사용하는 방법을 보여줍니다. 다양한 수준의 야생형 또는 돌연변이 TDP-43 발현을 가진 웜은 크롤링할 수 있으며, 이들의 움직임은 분석 플레이트의 중심점에서 이동한 반경 거리로 측정됩니다. 이 분석은 다양한 예쁜꼬마선충 균주가 이동한 거리에 따라 경증, 중등도 및 중증 운동 장애를 구별합니다.

프로토콜

1. 방사형 운동 분석

1. 직경 100mm 또는 150mm의 페트리 접시를 준비하고, 선충 성장 매체(NGM)를 절반 정도 채우고 한천의 전체 표면을 덮기 위해 OP50 박테리아의 균일한 잔디밭을 파종합니다.
2. NGM 분석 플레이트를 거꾸로 뒤집고 바닥에 분석할 C. elegans 균주에 대한 식별자(균주당 2개 플레이트)를 표시합니다(그림 1A).
3. 거꾸로 된 플레이트의 중앙에 마커가 있는 작은 점을 만듭니다(그림 1A).
4. 해부 현미경으로 작업하는 동안 백금 와이어 픽을 사용하여 15-20개의 병기 일치하는 웜을 중앙 점(NGM을 통해 볼 수 있음) 바로 위의 분석 플레이트 중앙으로 전송합니다(그림 1B).
   메모: 모든 웜을 동시에 또는 가능한 한 빨리 전송하십시오.
   1. 웜을 플레이트 중앙에 놓은 후 30분 동안 타이머를 설정합니다. 접시에 뚜껑을 다시 놓고 따로 보관합니다(그림 1C).
5. 모든 균주가 지정된 분석 플레이트에 있을 때까지 웜을 계속 옮기고 플레이트 간 이동에 걸리는 시간을 대략적으로 기록해 둡니다(플레이트 간 ~ 1분 목표). 모든 플레이트를 설정된 순서와 동일하게 유지하십시오.
6. 30분 후, 첫 번째 플레이트를 득점하기 시작합니다.
   1. 뚜껑을 제거하고 라벨이 부착된 플레이트의 뒷면이 위를 향하도록 플레이트를 해부 현미경 아래에 뒤집어 놓고 NGM 한천이 시선과 벌레 사이에 있도록 합니다. 접시는 정상적인 사용에서 거꾸로 됩니다.
   2. 한천을 통해 벌레가 보일 때까지 현미경 초점을 조정합니다.
   3. 중심점에서 다른 색상의 펠트 펜을 사용하여 각 벌레의 위치에 작은 점을 찍고 박테리아 잔디밭을 통해 벌레 발자국을 따라 가장 원위적인 동물을 찾으십시오.
   4. 일부 벌레가 거기에 들어갈 수 있으므로 접시의 가장자리를 확인하십시오. 또한 중심점 점에 있는 웜의 수를 세고 기록합니다(그림 1D).
7. 모든 플레이트가 30분의 활동 시간을 갖도록 모든 분석 플레이트를 순서대로 계속 표시하고, 플레이트를 설정하는 데 걸린 시간을 고려하여 주의하십시오. 그런 다음 1.8 또는 1.9 단계에 설명된 대로 수동 또는 디지털 측정을 수행합니다.
8. 눈금자를 사용하여 수동 측정을 수행합니다.
   1. 자를 사용하여 중심점에서 각 웜의 최종 위치 표시까지의 거리를 mm 단위로 측정하고 거리를 기록합니다. 득점하는 동안 진행 상황을 추적하는 데 도움이 되도록 첫 번째 득점 포인트에 작은 마킹 라인으로 레이블을 지정합니다.
   2. 플레이트를 시계 방향으로 회전하여 각 점의 길이 데이터를 연속적으로 기록합니다(그림 1E).
9. 스캐너와 ImageJ를 사용하여 디지털 측정을 수행합니다.
   1. 평판 스캐너를 사용하여 눈금자(스캐닝 표면을 향하는 숫자) 옆에 있는 분석 플레이트의 뒷면을 스캔합니다(그림 2A).
   2. ImageJ 또는 유사한 프로그램에서 스캔한 플레이트 이미지를 엽니다.
      메모: ImageJ는 NIH에서 호스팅하는 무료 Java 기반 이미지 처리 소프트웨어입니다.
   3. 직선 도구를 클릭한 다음 눈금자의 스캔된 이미지에서 1cm와 2cm 점을 연결하는 선을 그립니다(그림 2B).
      메모: Shift 컴퓨터 키를 누르고 있으면 선이 가장 가까운 45° 각도로 강제 조정됩니다.
   4. Analyze(분석) 메뉴로 이동하여 이를 사용하여 스케일(Analyze(분석) | 스케일 설정)을 참조하십시오(그림 2C).
   5. 해당 상자에 알려진 거리(10)와 길이 단위(mm)를 입력하고 픽셀 번호의 거리를 조정하지 마십시오. 각 ImageJ 세션에서 분석되는 모든 이미지에 동일한 배율을 적용하려면 Global을 선택합니다. 그렇지 않으면 열 때 각 이미지의 배율을 설정합니다(그림 2D). 확인을 클릭합니다.
      메모: 1.9.2-1.9.5 단계를 수행하여 측정 스케일을 설정합니다. 이 이미지에 대한 측정은 이제 선의 길이를 정의된 픽셀:길이 관계와 자동으로 연결합니다. 300dpi로 스캔한 이미지는 mm당 11.8픽셀의 대략적인 관계를 갖습니다.
   6. 페인트 브러시 도구를 사용하여 점수를 매길 첫 번째 포인트 바로 위에 표시합니다.
      메모: 점수가 매겨진 첫 번째 웜에 대한 시각적 지표입니다.
   7. Straight-Line Tool을 사용하여 중심점에서 첫 번째 웜 데이터 점까지 선을 그립니다.
   8. 키보드에서 M 키를 클릭하여 거리를 측정합니다. 또는 Analyze(분석) 메뉴로 이동하여 Measure(분석) | 측정). 두 경우 모두 측정이 새 창에 나타납니다. 이 창은 이미지당 모든 측정값을 수집합니다.
   9. 중심점을 일정하게 유지하면서 첫 번째 웜 포인트에 닿는 선의 끝을 다음 웜 포인트로 이동하고 시계 방향으로 이동한 다음 M 키를 클릭하여 측정합니다.
   10. 모든 점수가 득점될 때까지 시계 방향으로 각 지점을 계속 측정합니다.
   11. 길이 측정 데이터를 복사하여 스프레드시트에 붙여넣어 저장합니다. 그런 다음 스캔한 각 플레이트 이미지에 대해 프로세스를 반복합니다.
       메모: 1.9.6 - 1.9.11단계에서는 웜 변위 값을 측정합니다(그림 2E-F).
10. 통계 분석을 수행합니다.
    1. 단일 실험 내에서 반복실험을 결합하여 총 점수가 30-40개 사이가 되도록 합니다.
    2. 서로 다른 날에 독립적인 기생충 집단을 사용하여 독립적인 실험 반복을 수행하여 3개의 독립적인 실험 반복
    실험을 수행합니다.
    3. 2개의 균주에 대한 스튜던트 t-검정 또는 3개 이상의 균주에 대한 1-way ANOVA와 같은 적절한 통계 분석을 사용하여 데이터를 분석합니다.

결과

그림 1: 방사형 보행 분석 워크플로우. 패널 A-E은 방사형 운동 분석의 일반화된 단계를 보여줍니다. 단계는 다음과 같습니다: (A) OP50이 가장자리에 시드된 NGM 플레이트는 중앙 점을 라벨링하고 표시하여 준비되며, (B) 웜은 중앙 점으로 표시된 한천 중앙에 배치되며, (C) 웜은 일정 시간 동안 자유롭게 이동할 수 있습니다. (D) 플레이트를 아래에서 위로 뒤집고 각 웜의 최종 위치를 중앙 점과 다른 색상으로 표시합니다.(E) 중앙 점에서 각 최종 웜 위치까지의 거리는 수동 또는 디지털 방식으로 측정됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C. 예쁜꼬마선	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	-	원하는 대로 균주를 획득하면 N2는 유용한 제어 변형률
일회용 파스퇴르 피펫, 붕규산 유리	폭스바운드	14673-010	웜 픽을 만드는 데 사용되는 유리 피펫 - 한 손에는 유리 피펫을 들고 다른 손에는 ~ 1 인치의 백금 와이어 (펜치로 잡음)를 화염 위에 올려 놓습니다.
일회용 페트리 접시, 35x10mm	폭스바운드기	10799-192	WormLab 이미징 시스템용 어세이 플레이트
일회용 페트리 접시, 60x15mm	폭스바운드기	25384-090	지렁이용 스톡 플레이트
일회용 페트리 접시, 100x15mm	폭스바운드기	25384-302	표준 방사형 이동 분석 플레이트
일회용 페트리 접시, 150x15mm	폭스바운드	25384-326	더 긴 시간 프레임의 방사형 이동 분석 플레이트
해부 현미경	라이카	M80	웜 유지 관리 및 방사형 운동 분석 설정 범위
끝이 세밀한 마커	폭스바운드	52877-810	방사형 이동 분석을 위해 최소 2가지 색상이 필요합니다. 정확성을 위해 미세한 팁이 필요합니다.
평판 스캐너	아마존	엡손 퍼펙션 V850	방사형 이동 분석에 선택 사항입니다. 프로토콜은 해상도가 300dpi라고 가정하면 대부분의 스캐너는 잘 작동합니다
NGM (선충 성장 배지)	폭스바운드	76347-412	C. elegans를 재배하는 데 사용되는 매체. 처음부터 만들 수 있습니다, WormBook: Maintenance of C. elegans
OP50 박테리아	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	예쁜꼬마선충의 주요 식량 공급원
P1000 피펫터	폭스바겐	76207-552	수영 분석에 사용되는 피펫터
p1000 팁	폭스바운드기	83007-384	수영 분석에 사용되는 피펫터 팁
백금 와이어, 직경 0.2032mm	폭스바운드기	BT136585-5M	웜 픽을 만드는 데 사용되는 미세 게이지 백금 와이어 - 한 손에는 유리 피펫을 잡고 다른 손에는 ~ 1 인치의 백금 와이어 (펜치로 잡기)를 화염 위에 올려 결합합니다.
통치자	폭스바운드기	56510-001	방사형 운동 분석에 점수를 매겨야 함
이미지J	국립보건원	-	에서 제공하는 선택적 무료 소프트웨어 국립보건원(NIH) - https://imagej.nih.gov/ij/
웜랩 이미징 시스템	MBF 바이오사이언스	웜랩	이미징 시스템에는 가 포함됩니다. WormLab 하드웨어 (명시야 무대, 카메라, 주택) 및 WormLab 소프트웨어. https:// www.mbfbioscience.com/wormlabimaging- 시스템