동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 준비
- 조직 준비 및 절편
- 쥐를 신선/식염수(SAL, 0.9% NaCl), 접두사/SAL 및 접두사/3,4-메틸렌디옥시메스암페타민(MDMA, 표 1의 세부 정보 참조)의 세 그룹으로 무작위로 할당합니다.
- 2시간 간격으로 SAL 및 MDMA 그룹에 각각 1ml/kg SAL 및 10mg/kg MDMA를 복강내로 3회 투여합니다. 동물이 6일 동안 치료에서 살아남을 수 있도록 합니다.
- 7일째에 5mg/kg 자일라진을 복강내로 조합하여 100mg/kg 케타민을 쥐에게 투여하여 깊은 마취(즉, 각막 깜박임 및 꼬리 꼬집 반사 상실)
를 합니다.
- 신선/SAL 그룹의 경우 신선한 뇌 검사를 위해 쥐의 목을 빠르게 자르고 뇌를 제거합니다.
- 접두사/SAL 및 접두사/MDMA 그룹의 경우 흉골을 따라 약 10-12cm 정도 절단한 다음 흉골 끝을 노출시킵니다.
- 지혈로 흉골 끝을 잡고 날카로운 가위로 횡격막을 양쪽 측면으로 자른 다음 갈비뼈를 가로질러 위쪽으로 자르고 폐와 평행하게 자릅니다.
- 한 손으로 작은 집게로 심장의 복부 끝을 잡습니다. 다른 손으로 18G 주사기 바늘로 좌심실을 뚫습니다(바늘의 어댑터 면은 Y자형 실리콘 호스로 얼음처럼 차가운 SAL과 파라포름알데히드 용기 및 연동 펌프에 연결되어 있습니다).
- 중간 수준의 유속(~5ml/min)에서 SAL 펌프를 켜고 집게로 오른쪽 심방에 구멍을 뚫어 복귀 순환이 빠져나갈 수 있도록 합니다. 30분 동안 SAL 관류를 유지합니다.
- 파라포름알데히드 펌프를 중간 수준으로 켜고 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드가 동물을 30분 동안 관류시키도록 합니다.
- 관류 기구를 제거하고 동물의 목을 베십시오. 두개골의 정중선을 후전방으로 절단한 다음 두개골을 펄럭여 두개강을 노출시킵니다.
- 두개골강에서 주걱으로 뇌를 제거하고 4% 파라포름알데히드 25ml가 들어 있는 50ml 원심분리 튜브에 뇌를 넣습니다. 파라포름알데히드 함유 튜브 안에 뇌를 4ºC 냉장고에서 24시간 동안 보관합니다.
- 30% 자당 용액 25ml가 들어 있는 50ml 원심분리 튜브에 뇌를 넣고 4ºC에서 3일 동안 방치합니다. 마지막으로, 뇌를 사용할 때까지 -80°C의 비닐 봉지에 보관하십시오.
- 임베딩 매체가 있는 척에 뇌를 장착하고 뇌가 포함된 임베딩 매체를 -26ºC의 온도에서 저온 유지 장치에 동결합니다. 신선하게 얼어붙은 뇌를 20μm 절편으로 자르고 파라포름알데히드 접두사가 붙은 뇌를 10μm 절편으로 자릅니다. 슬라이드를 섹션으로 터치하여 섹션을 실온(RT) 현미경 슬라이드로 이동합니다.
- RT에서 4시간 동안 자연 건조합니다. 사용할 때까지 -80°C에서 단단히 밀봉된 백에 섹션 슬라이드를 보관하십시오.
- 탈수
- -80°C 냉동고에서 슬라이드를 가져와 세 가지 테스트 중 하나로 섹션을 할당합니다: 세로토닌 5-HT2A 수용체 유전자(ht2a), ppiB(펩티딜프롤릴 이소머라제 B 유전자, 양성 대조군) 또는 dapB(박테리아 디하이드로디피콜리네이트 환원효소 유전자, 음성 대조군);볼펜으로 섹션을 표시하고 라벨을 붙입니다(연필을 사용하지 마십시오). RT에서 5분 동안 슬라이드를 100% 알코올에 담그십시오. 흄 후드에서 슬라이드를 5분 동안 건조시킵니다.
- 전처리
- Pretreatment-20 시약의 1 μl(알칼리성 인산가수분해효소 불활성화)를 슬라이드의 섹션에 피펫팅합니다. 슬라이드를 수분 트레이의 랙 레일에 놓습니다(트레이는 반응 용액의 증발을 방지하기 위해 높은 습도를 유지하기 위해 뚜껑으로 덮여 있음).
- 수평 셰이커의 수분 트레이를 10분 동안 저속으로 부드럽게 흔듭니다. 이중 증류수(ddH2O)로 슬라이드를 2분 동안 두 번 세척합니다. Pretreatment-2 시약 150ml가 들어 있는 200ml 비커에 슬라이드를 담급니다(파라포름알데히드 고정에 의해 유도된 가교 결합 파괴). 슬라이드를 100ºC에서 총 5분 동안 끓입니다(RNA 구조의 열 유도 복원).
- ddH2O로 슬라이드를 2분 동안 두 번 세척합니다. 슬라이드를 100% 알코올에 5분 동안 넣고 흄 후드에서 5분 동안 건조시킵니다. 소수성 펜을 사용하여 조직 단면에서 선택한 영역(예: 그림 1에 설명된 바와 같이 시상 및 시상하부를 포함한 비피질 구조) 주위에 원을 그립니다.
- Pretreatment-3 시약 10μl를 선택한 각 영역에 피펫팅하고(프로브 침투 증가) 수분 트레이를 뚜껑으로 덮습니다. 수평 셰이커가 장착된 하이브리드화 오븐에 트레이를 놓고 오븐 온도를 40ºC로 설정합니다. 트레이를 30분 동안 부드럽게 흔듭니다. ddH2O로 2분 동안 슬라이드를 두 번 세척합니다.
2. 하이브리드화 및 증폭
- 선택한 영역에 각각 10μl의 htr2a, ppiB 및 dapB 프로브 시약을 피펫팅합니다. 시약의 증발을 방지하기 위해 수분 트레이를 뚜껑으로 덮으십시오. 수평으로 설정된 셰이커를 저속으로 가볍게 흔듭니다. 슬라이드를 40ºC의 오븐에서 2시간 동안 배양합니다.
- 세척액으로 슬라이드를 2분 동안 두 번 세척합니다. 선택한 각 영역에 Amplification-1 시약 10μl를 피펫팅하고 슬라이드를 흔들어 40ºC에서 30분 동안 배양합니다.
- 세척 버퍼로 슬라이드를 2분 동안 두 번 세척합니다. 선택한 각 영역에 Amplification-2 시약 10μl를 피펫팅하고 슬라이드를 흔들어 40ºC에서 15분 동안 배양합니다.
- 세척 버퍼로 슬라이드를 2분 동안 두 번 세척합니다. 선택한 각 영역에 Amplification-3 시약 10μl를 피펫팅하고 슬라이드를 흔들어 40ºC에서 30분 동안 배양합니다.
- 세척 버퍼로 슬라이드를 2분 동안 두 번 세척합니다. 선택한 각 영역에 Amplification-4 시약 10μl를 피펫팅하고 슬라이드를 흔들어 40ºC에서 15분 동안 배양합니다.
- 세척 버퍼로 슬라이드를 2분 동안 두 번 세척합니다. 선택한 각 영역에 Amplification-5 시약 10μl를 피펫팅하고 슬라이드를 흔들어 30분 동안 상온에서 배양합니다.
- 세척 버퍼로 슬라이드를 2분 동안 두 번 세척합니다. 선택한 각 영역에 Amplification-6 시약 10μl를 피펫으로 넣고 15분 동안 실온에서 슬라이드를 흔들고 배양합니다. 세척 버퍼로 2분 동안 슬라이드를 두 번 세척합니다.
3. 신호 감지
- 선택한 각 영역에 10μl의 적색 시약을 피펫팅합니다(시약은 1:60 비율로 적색-B와 적색-A를 혼합한 것이므로 즉시 사용해야 함). 수평 셰이커의 수분 트레이에 슬라이드를 RT로 놓고 저속으로 10분 동안 부드럽게 흔듭니다.
- 10분 동안 (ddH2O)로 슬라이드를 두 번 세척합니다. 오븐에서 15분 동안 60ºC에서 슬라이드를 건조시킵니다. 5분 동안 흄 후드 아래에 자일렌에 슬라이드를 놓습니다. 선택한 각 영역에 20μl의 자일렌 기반 장착 매체를 피펫팅하고 커버 슬립으로 덮습니다.