마우스 뇌 슬라이스의 소뇌 Purkinje 뉴런에서 장기 우울증의 유도

초록

출처: Yamaguchi, K., et al.성인 소뇌 절편에서 장기 우울증 유도 평가. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오에서는 마우스 소뇌 절편을 사용하여 운동 제어에 필수적인 평행 섬유, 등반 섬유 및 Purkinje 세포 간의 시냅스 상호 작용을 조사했습니다. 등반 섬유의 자극은 Purkinje 세포에 장기 우울증(LTD)을 유발하여 시냅스 강도를 약화시키고 평행 섬유 자극에 대한 반응을 감소시켰습니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 브레인 슬라이싱

1. 소뇌의 등쪽이 앞쪽에 오도록 샘플의 방향을 지정합니다. 소뇌를 완전히 잠기기에 충분한 1μM TTX(테트로도톡신)를 함유한 얼음처럼 차가운 절단 ACSF(인공 뇌척수액)를 붓습니다. 가스 튜브를 ACSF에 넣고 O₂/CO₂ 가스 혼합물로 거품을 일으키기 시작합니다.
2. 쌍안경 아래의 미세한 핀셋을 사용하여 지주막을 제거합니다. 칼날로 소뇌 꽃자루를 자르고 뇌간과 한천 블록을 제거합니다. 트레이를 180° 회전하여 소뇌의 등 표면이 면도날을 향하도록 합니다.
3. 날을 설정하고 첫 번째 절단 위치를 조정합니다. 비브라톰 슬라이싱 매개변수를 진폭을 5.5, 주파수를 85Hz, 속도를 3–4, 슬라이스 두께를 300μm로 설정합니다.
4. 나일론 그물에 있는 소뇌 절편을 아크릴 인큐베이터로 옮기고 산소가 공급된 ACSF에 절편을 완전히 담그십시오. 인큐베이터는 26°C의 온도를 유지하는 수조에 넣어야 합니다.
5. 슬라이스하는 동안 손상을 복구할 수 있도록 슬라이스를 최소 1시간 동안 보관하십시오.

2. 전체 셀 패치 클램프 기록

참고: 패치 클램프 기록에는 적외선 미분 간섭 대비(IR-DIC) 광학 장치가 있는 정립 현미경, 패치 클램프 증폭기, 데이터 디지타이저, 디지털 자극기, 아이솔레이터, 컴퓨터, 데이터 수집 및 분석용 소프트웨어, 전동 매니퓰레이터, 현미경 플랫폼, 진동 차단 테이블, 패러데이 케이지, 용액 가열 시스템, 연동 펌프 및 전극 풀러

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1. ACSF에 픽크로톡신(0.1mM)을 첨가하고 3분 동안 초음파 처리를 사용하여 해결합니다.
2. 피크로톡신이 함유된 O2-CO2 포화 ACSF를 2mL/분의 속도로 기록 챔버를 관류합니다. 기록 챔버의 온도를 약 30°C로 유지합니다.
3. 4단계 풀러를 사용하여 필라멘트(외경 = 1.5mm)가 있는 붕규산 유리 모세관을 당겨 기록 전극을 만듭니다. 팁 직경은 약 1μm여야 합니다.
4. 풀러를 사용하여 동일한 모세관을 2단계로 당겨 자극 전극을 만든 다음 쌍안 현미경으로 철 블록에 팁을 두드려 미세한 팁을 만들기 위해 끊습니다. 최종 직경은 3–5μm여야 합니다.
5. 소뇌 절편을 기록 챔버로 옮기고 나일론 실이 있는 Pt-weight로 고정합니다. 자극 전극에 ACSF를 채웁니다.
6. PF를 자극하기 위해 자극 전극을 Purkinje 세포층에서 약 50μm 떨어진 분자층 표면에 놓습니다.
7. CF를 자극하기 위해 자극 전극을 Purkinje 세포층의 바닥에 놓습니다(단계 3.3, 3.4).
8. 0.45μm 필터가 있는 K⁺ 기반 또는 Cs⁺ 기반 내부 용액을 필터링합니다. 마이크로 로더를 사용하여 기록 전극에 8μL의 내부 용액을 채웁니다.
9. ACSF에 담그기 전에 기록 전극에 약한 양압을 가하십시오. 저항은 2-4MΩ이어야 하며 액체 접합 전위를 수정해야 합니다.
10. 기록 전극으로 PC의 건강하고 밝은 세포체에 접근합니다. Purkinje 셀의 표면을 약간 밀고 양압 적용을 중지한 다음 기가 옴 씰을 형성할 때까지 음압을 가합니다. 그런 다음 음압을 사용하여 전체 세포 구성을 설정합니다.
11. 멤브레인 전위를 -70mV로 유지하고 0.1Hz에서 -2mV 펄스(지속 시간, 100ms)를 적용하여 입력 저항, 직렬 저항 및 입력 커패시턴스를 지속적으로 모니터링합니다. 직렬 저항 보상을 사용하지 마십시오. 직렬 저항이 15% 이상 변하는 경우 데이터를 삭제합니다.

3. LTD 유도 (장기 우울증)

1. 펄스(지속 시간, 0.1ms)로 분자층을 자극합니다. 이중 펄스 자극(50ms의 인터스파이크 간격(ISI))을 적용하여 PF(Parallel fibers)-흥분성 시냅스후 전류(EPSC)를 식별합니다. PF-EPSC는 자극 강도의 증가에 비해 쌍 펄스 촉진과 진폭의 점진적인 증가를 보여야 합니다.
2. 0.1Hz에서 단일 펄스를 적용하여 PF-EPSC의 테스트 응답을 기록합니다. 유발된 EPSC 진폭이 약 200pA가 되도록 자극의 강도를 조정합니다. 전압 의존 이온 채널을 통한 전류 오염을 피하십시오.
3. Purkinje 세포층의 맨 아래에 있는 CF를 자극하고 CF 활성화에 의해 유도된 EPSC를 식별합니다(이중 펄스 자극을 적용하여). CF-EPSC는 자극 강도의 증가에 따라 paired-pulse depression 및 all or none 방식을 보여야 합니다. LTD 유도의 경우 단일 자극을 사용해야 합니다.
4. LTD 유도 프로토콜 1
   1. 전류 클램프 조건에서 K⁺ 기반 내부 용액이 포함된 전극을 사용하여 단일 PF 자극과 단일 CF 자극을 1Hz에서 5분(300펄스) 동안 동시에 적용합니다(그림 1A).
5. LTD 유도 프로토콜 2
   1. 전류 클램프 조건에서 전극 함유 K⁺ 기반 내부 용액을 사용하여 두 번째 PF 자극이 1Hz에서 5분 동안 CF 자극과 일치하므로 이중 PF 자극(ISI 50ms)과 단일 CF 자극을 적용합니다(그림 1B).
6. LTD 유도 프로토콜 3
   1. 전압 클램프 조건에서 Cs⁺ 기반 내부 용액을 포함하는 전극을 사용하여 이중 PF 자극(ISI 50ms)과 단일 탈분극 전압 단계(-70 - 0mV, 50ms)를 1Hz에서 3분 동안 소마에 적용하여 두 번째 PF 자극이 탈분극 전압 단계의 시작과 동일하도록 합니다(그림 1C).
7. LTD-유도 프로토콜-4
   1. 전압 클램프 조건에서 Cs⁺ 기반 내부 용액이 포함된 전극을 사용하여 PF 자극(100Hz에서 5배)과 단일 탈분극 전압 단계(-70 - 0mV, 50ms)를 0.5Hz에서 3분 동안 동시에 소마에 적용합니다(그림 1D).

결과

그림 1: PF-PC 시냅스에서 LTD를 유도하기 위한 프로토콜의 개략도. (A) 프로토콜 1 Cj. 1 PF 및 1 CF 자극은 전류 클램프 조건에서 1Hz(5분)에서 동시에 300회 적용됩니다. 전세포 기록용 전극에는 K⁺ 기반 내부 용액이 포함되어 있습니다. (B) 프로토콜 2 Cj. 2 PF 및 1 CF 자극은 전류 클램프 조건에서 1Hz(5분)에서 동시에 300회 적용됩니다. 전극에는 K⁺ 기반 내부 용액이 포함되어 있습니다. (씨) 프로토콜 3 Cj. 2 PF 및 체세포 탈분극(-70 - 0 mV, 50 ms)은 전압 클램프 조건에서 1 Hz(3분)에서 180회 적용되므로 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
증폭기	분자 장치-축삭돌기	멀티클램프 700B
붕규산 유리 모세관	셔터	BF150-110-10
디지타이저	분자 장치-축삭돌기	디지데이터1322A
전극 풀러	셔터	모델 P-97
이소플루란	후지필름 Wako 퓨어 케미칼	26675-46-7
아이솔레이터	오전	아이소플렉스
선형 슬라이서	도사카 EM	프로7N
현미경	니콘	이클립스 E600FN
연동 펌프	길슨	MP1 단일 채널 펌프
픽트로톡신	시그마-알드리치	P1675
순수한 물 메이커	머크-밀리포어	밀리큐 7000
실험용 소프트웨어	분자 프로브-축삭돌기	p클램프 10
통계 소프트웨어	킨스랩	카이플롯 5.0
자극기	WPI	DS8000
온도 조절기	워너	TC-324B
테트로도톡신	토크리스	1078