혈액-뇌 장벽과 뇌 세포 감염의 병원체 교차를 연구하기 위한 체외 모델

초록

출처: da Costa, A., et al. 병원체 또는 약물에 의한 장벽 횡단 및 뇌와의 상호 작용을 연구하기 위한 인간 혈액-뇌 인터페이스 모델. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 혈액뇌장벽(BBB)을 통과하는 병원체를 연구하기 위한 체외 모델을 보여줍니다. 밀접한 연접을 발현하는 미세혈관 내피 세포는 상부 챔버에서 내피층을 형성하고, 뉴런, 성상세포, 미세아교세포는 다공성 막으로 분리된 하부 챔버의 뇌 실질을 나타냅니다. BBB 모델의 바이러스 감염은 혈액에서 뇌로 전달되는 병원체를 모방합니다. 신경친화성 바이러스를 도입하면 트랜스사이토시스(transcytosis)를 통해 BBB를 교차하여 신경 세포를 감염시키고 바이러스 자손을 복제 및 방출하여 성공적인 신경 침입을 보여줍니다.

프로토콜

1. BBB-Minibrain(Blood-brain barrier - Minibrain)의 구성 및 품질관리 (그림 1)

1. BBB-Minibrain 폴리에스터 멤브레인 배양 삽입 장치 설정(그림 1B)
   1. 실험에 사용하기 전에 12웰 폴리에스터 멤브레인 배양 인서트 필터에서 12웰 폴리에스터 멤브레인 배양 인서트 필터에서 인간 뇌 내피 세포주(hCMEC/D3 세포)를 성장시킵니다.
   2. 12웰 플레이트를 폴리-D-라이신(1mL/웰, 10μg/mL, RT에서 4시간)으로 코팅한 다음 라미닌(1mL/웰, 1μg/mL, RT에서 하룻밤)으로 코팅합니다.
   3. 라미닌을 제거하고 5% 소 태아 혈청(FBS)(5% 내피 세포 배지)이 보충된 1mL의 내피 세포 배지를 추가합니다.
   4. 37 ° C, 5 % CO₂ 및 95 % 습도에서 1 시간 동안 배양합니다.
   5. 유사분열 후 인간 뉴런(hNeurons) 및 인간 성상세포(hAstrocytes)(NT2-N/A) 및 인간 미세아교세포주(CHME/Cl5)를 부드럽게 트립신화하고 세포 펠릿을 완전한 내피 세포 배지로 해리합니다.
   6. 세포를 세고 3.6 x 10⁵ NT2-N/A와 0.4 x 10⁵ CHME/Cl5 세포/웰을 혼합하고 12웰 플레이트를 시드합니다.
   7. T=24시간(파종 후 24시간): 사용한 배지를 새로운 완전 내피 세포 배지(Minibrain 세포 및 내피 세포)로 변경하고 Minibrain 세포 상단에 hCMEC/D3 폴리에스터 멤브레인 배양 삽입 필터를 옮깁니다. BBB-Minibrain을 37°C, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 배양합니다.
      참고: BBB-Minibrain은 내강 구획(또는 "혈액" 구획)을 분리하는 필터의 인간 내피 세포 hCMEC/D3 층과 절대 구획(또는 "뇌" 구획)을 정의하는 웰 바닥에 있는 인간 세포 hNT2-N/A 및 hCHME/Cl5(Minibrain)의 혼합 배양으로 구성됩니다(그림 1B).
2. BBB-Minibrain의 내피 투과성 검증(품질 관리) (그림 1C)
   1. 10mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 및 1mM 피루브산나트륨이 보충된 Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 가 포함된 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution) 완충액인 수송 완충액(TB)을 준비합니다.
   2. 웰당 1.5mL의 수송 버퍼가 있는 12개의 웰 플레이트를 준비합니다.
   3. T= 0에서 50μM Lucifer Yellow(LY-TB)가 보충된 새로운 수송 버퍼를 만듭니다.
   4. 각 필터를 거꾸로 뒤집어 내피 세포 장벽에 영향을 주지 않고 매체를 조심스럽게 제거합니다.
   5. 채워진 12웰 플레이트에 필터를 놓고 LY-TB 0.5mL를 추가합니다.
   6. 37°C, 5% CO₂ 및 95% 습도의 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다.
   7. T=10분에서 새로운 TB로 채워진 12개의 웰 플레이트에 필터를 옮기고 OD 판독을 위해 첫 번째 플레이트의 절대 구획을 유지합니다.
   8. T= 25분에서 1.2.7단계를 반복합니다.
   9. T= 45분에서 플레이트에서 필터를 제거하여 운송을 중지합니다. OD 측정을 위해 abluminal 및 luminal 구획을 유지하십시오.
   위치
   10. 어두운 96웰 플레이트에서 샘플을 이송합니다: LY-TB 및 루미널 컴파트먼트의 경우 190μL TB가 포함된 10 μL, 아발미널 컴파트먼트의 경우 200 μL의 샘플.
   11. λ428 nm, λ535 nm(각각 여기 및 방출 길이, 파)에서 서로 다른 샘플에 존재하는 LY-TB의 형광을 측정합니다.
   12. 다음 공식을 사용하여 LY-TB (Pe_LY) 방향의 내피 투과성(Pe)을 계산합니다.
       1/PSe= (1/PSt) – (1/PSf) 및 Pe_LY= PSe/S.
       참고: PSf는 셀이 없는 필터의 투과성, PSt는 셀이 있는 필터의 투과성, PSe는 단층 표면의 내피 단층 시간 시간의 투과성, S는 단층의 표면(12웰 필터의 경우 = 1.12cm²), Pe_LY는 cm/min으로 표시됩니다. hCMEC/D3의 경우 Pe_LY는 주로 실험에 사용된 FBS에 따라 0.7에서 1.2 x 10^-3 cm/min 사이여야 합니다. 중요: Pe_LY가 1.2보다 높으면 BBB가 충분히 조여지지 않았고 약간의 누출이 관찰될 수 있음을 의미합니다. 이러한 장벽을 버리십시오.

2. 황열병 바이러스 백신 샘플, 프랑스 신경친화성 바이러스, YFV-FNV 34에서 신경 침습성 바이러스 입자의 존재를 강조하기 위해 BBB-Minibrain을 사용(그림 2)

1. 미니브레인에서 황열병 바이러스의 BBB 교차 및 증식
   1. 바이러스를 추가하기 24시간 전에 1.1.7단계에서 설명한 대로 준비된 BBB-Minibrain을 사용하십시오. 배지를 2% FBS 내피 세포 배지로 교체합니다.
      참고: 바이러스를 추가하기 직전에 매체를 변경하지 않는 것이 매우 중요합니다. 배지를 변경하면 인간 내피 세포가 활성화되고 장벽이 일시적으로 열려 바이러스가 통과할 수 있습니다. 여기서 배지는 실험을 시작하기 24시간 전에 변경됩니다.
   2. T= 0에서 50μL의 2% FBS 내피 세포 배지에 희석된 YFV-FNV의 3500 PFU(Plaque Forming Unit)를 내강 구획 상단에 매우 조심스럽게 추가합니다. 대조군 BBB-Minibrain은 바이러스가 없는 2% FBS 내피 세포 배지 50μL를 접종합니다. 동반자에서 Pe_LY를 잘 결정합니다.
   3. BBB-Minibrain을 37°C, 5% CO₂ 및 95% 습도의 인큐베이터에서 배양합니다.
   4. 24시간 후 폴리에스터 멤브레인 배양 삽입물 필터 장치를 제거하고 Pe_LY, 앱루멘 격실에서 1mL 샘플을 측정하고 바이러스를 적정합니다. 배지를 새로운 2% FBS 내피 세포 배지로 교체합니다.
   5. BBB-Minibrain을 37°C, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 배양합니다.
   6. 72시간 후, abluminal compartment에서 배지를 샘플링하고 바이러스를 적정하거나 유전자 발현 분석을 위해 Minibrain 세포에서 RNA를 추출합니다.

결과

그림 1: BBB-Minibrain 모델. A입니다. hCMEC/D3 배양 시간표 및 BBB-Minibrain 장치의 사진: hCMEC/D3 내피 장벽이 있는 폴리에스터 멤브레인 배양 삽입 필터를 12웰 세포 배양 플레이트의 한 웰에 삽입하기 전에 집게로 고정합니다. B입니다. 내피 세포 장벽을 포함하는 내강(혈액) 구획과 미니 브레인 세포(인간 뉴런, 성상 세포 및 미세아교세포)를 포함하는 abluminal(뇌) 구획이 있는 장치를 설명하는 만화. C입니다. 3개의 장치에서 TEER(즉, TransEndothelial Electrical Resistance)에 의한 BBB-Minibrain 투과성의 대표적인 측정 또는 5개의 필터에서 LY(즉, PeL...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
12웰 플레이트	코닝	3336
85mm 페트리 접시	사르스테트	83-3902-500
CHME/Cl5	Unité de Neuroimmunologie Virale	라폰 박사에게 요청
CMC	칼비오켐	217274
다크 96웰 플레이트	코닝	3915
DMEM F12	써모피셔 사이언티픽	31330-038
DMSO	머크-시그마 알드리치	D2650
엔도로 IV	밀리포어	SCME004
에탄올	카를로 에르바	529121
FBS	하이클론	SV30015-04	내피 세포 배지
Ca2+-Mg2+	써모피셔 사이언티픽	14025-100
hCMEC/D3	시다레인	클루512
헤페스 1M	써모피셔 사이언티픽	15630-070
라미닌	머크 시그마 알드리치	L6274
L-글루타민	써모피셔 사이언티픽	25030-024
루시퍼 옐로우	머크-시그마 알드리치	L0259
MEM 10배	써모피셔 사이언티픽	21430
MEM 1X	써모피셔 사이언티픽	42360
은테라/CL2D.1	ATCC	CRL-1973
파라포름알데히드	전자 현미경 과학	15,714
Ca가 없는 PBS2+-Mg2+	써모피셔 사이언티픽	14190
PBS-CA2+-MG2+	써모피셔 사이언티픽	14040-091
펜/스트렙	유로바이오	CXXPES00-07
폴리-디-라이신	머크-시그마 알드리치	P1149
금 연장	써모피셔 사이언티픽	P36930
RNA 정제 키트	키아겐	74104
중탄산나트륨 5.6%	유로바이오	CXXBIC00-07
피루브산나트륨	써모피셔 사이언티픽	11360
T75 셀+ 플라스크	사르스테트	83-1813-302	민감한 부착 세포를 위한 특정 표면 처리(Cell+)가 있는 조직 배양 폴리스티렌 플라스크
트랜스웰	코닝	3460	폴리에스터 다공성 멤브레인 배양 인서트
트립신-EDTA	머크-시그마 알드리치	T3924
초순수	써모피셔 사이언티픽	10977-035
베르센	써모피셔 사이언티픽	15040-033	EDTA
YFV-FNV	IP 다카르	백신 바이알

를 사용한 HBSS 위치