신경교세포의 단세포 이미징을 위한 초파리 뇌의 면역형광 염색

초록

출처: Batelli, S., et al. 초파리에서 고분해능 단일 세포 형태 및 신경교세포의 세포 상호 작용을 연구하기 위한 MultiColor FlpOut 기술의 적용. , J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 신경교세포의 단세포 이미징을 위한 형질전환 초파리 뇌의 면역형광 염색을 보여줍니다. 뇌는 신경교세포 특이적 재조합효소 시스템의 제어 하에 항원 항원결정기의 다양한 조합과 융합된 막 표적 단백질을 발현합니다. 분리되고 고정된 뇌는 항원 항원결정기에 특이적인 1차 항체로 염색된 후 형광단 접합 2차 항체로 염색됩니다. 이 라벨링을 통해 다양한 뇌 영역에 걸쳐 서로 다른 신경교세포 하위 집단을 동시에 이미징할 수 있습니다.

프로토콜

1. MCFO(MultiColor FlpOut) 실험을 위한 파리 준비

참고: MCFO 기법은 FlpOut(Flp-mediated stop cassette excision)의 수정된 버전을 나타냅니다. 형질전환 MCFO 파리는 열 충격 촉진제(hsp)-Flp 재조합효소 및 업스트림 활성화 서열(UAS) 제어 하에 있는 다른 리포터를 운반합니다. 각 리포터는 myristoylated (myr) super folder green fluorescent protein (sfGFP)의 공통 골격으로 구성되며, 여기에 10개의 epitope tag (예: HA, FLAG 또는 V5) 사본이 삽입되어 있습니다. 그 결과로 생성된 비형광 단백질은 "스파게티 몬스터 GFP"(smGFP)로 명명되며 다양한 에피토프 태그에 대한 특정 항체를 사용하여 검출할 수 있습니다.

1. MCFO 카세트 및 hsp-Flp(hsp-Flp, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5)를 사용하여 적절한 glial GAL4 드라이버 라인으로 크로스 플라이합니다(재료 표 참조).
   1. hsp는 이미 25°C에서 활성화되어 있고 불특정 표지로 이어지는 재결합을 거칠 수 있는 세포가 거의 없기 때문에 시스템의 누출을 방지하기 위해 18°C에서 크로스를 설정합니다. F18 세대를 얻으려면 18°C에서 약 20일 동안 기다리십시오. 열 충격 후(2단계 참조) 파리를 25°C로 유지합니다(그림 1).

2. 히트 쇼크

참고: 삽입 부위에 따라 hsp-Flp의 효율이 다를 수 있으므로 최적의 열 충격 시간을 최적화해야 합니다. 이 프로토콜의 경우, hsp-Flp가 X 염색체에 삽입된 MCFO 플라이 스톡이 사용되었습니다(재료 표 참조).

1. 1.1단계(F1 세대 파리, 3-4일령)에서 십자가의 자손을 음식이 들어 있는 새 바이알에 옮기고 수조에서 37°C에서 열 충격을 가합니다.
   메모: 어린 파리(생후 1-2일)는 열 쇼크에 매우 민감합니다. 치료로 인한 사망률을 줄이기 위해 열 충격을 수행하기 전에 1-2일 더 기다리십시오. 일부 F1 세대 플라이를 열 충격 없이 컨트롤로 사용하십시오.
2. 열 쇼크가 발생하는 동안에는 스트레스로 인한 사망률을 줄이기 위해 음식과 함께 일반 바이알에 파리를 보관하십시오. 암컷과 수컷을 별도의 바이알에 넣습니다.
3. 균일한 열 충격을 보장하기 위해 바이알 전체를 물에 담그십시오. 많은 GAL4 driver line이 있는 신경교세포의 희소 라벨링을 위한 적절한 시작점으로 5-8분의 충격을 사용합니다. 충격 지속 시간은 각 운전자 및 실험에 맞게 최적화해야 합니다(더 짧거나 더 긴 열 충격 시간이 필요할 수 있음).
4. 열 충격 후 파리가 열 충격에서 회복할 수 있도록 몇 분 동안 유리병을 벤치에 수평으로 놓으십시오.
   메모: 바이알을 변경할 필요가 없습니다.
5. 파리를 25°C로 유지하고 최적의 리포터 발현을 위해 열 충격 후 2일 이상 파리를 해부(3 및 4단계 참조)합니다.

3. 해부 준비 및 해결 방법

1. 해부 당일, 180μL의 S2 세포 배양 배지와 20μL의 20% 파라포름알데히드(PFA)를 혼합하여 2% PFA 용액을 얻어 200μL PCR 튜브에 새로운 정착액을 준비합니다. 해부 전과 해부 중에 얼음 위에 정착액을 유지하십시오.
   주의: PFA는 독성이 있으므로 주의해서 다루어야 합니다.
   메모: 200μL 중합효소연쇄반응(PCR) 튜브에서 160μL의 S2 세포 배양 배지와 40μL의 20% 파라포름알데히드(PFA)를 혼합하여 2% 용액 대신 4% PFA 용액을 준비합니다.
2. 최적의 염색 결과를 위해 튜브당 최대 8-10개의 뇌가 있는 유전자형당 하나의 PCR 튜브를 사용하십시오.
3. 성인 세뇌 세척 용액 준비: 0.5% 소 혈청 알부민, 0.5% 트리톤 X-100 인산염 완충 식염수(PBS).
   참고: 염색에 따라 1% Triton X-100을 함유한 용액이 필요할 수 있습니다. 트리톤 X-100의 농도가 높을수록 항체가 조직 안으로 침투하는 속도가 증가하므로 조직 내부 깊숙이 있는 영역(예: 성인 초파리 뇌의 시냅스 영역)을 염색해야 합니다.
4. 차단 용액 준비: PBS의 일반 염소 혈청 3%, 일반 당나귀 혈청 3%, 트리톤 X-100 0.5%.
5. 성인용 세뇌 세척 용액과 차단 용액은 4 °C에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.
6. 깊은 함몰 우물 유리판을 얼음 위에 놓고 각 우물을 70% 에탄올, PBS, S2 세포 배양 배지로 채웁니다.

4. 성인 뇌 해부

1. 실체현미경의 스테이지에 3cm 해부 접시를 놓고 차가운 S2 세포 배양 배지로 채웁니다. 해부 절차 중에 조직이 건강하게 유지되도록 이 매체에서 모든 해부를 수행합니다.
   메모: (이미지에서) 좋은 배경 대비를 제공하는 수 밀리미터의 검은색 실리콘이 깐 해부 접시를 사용하고 해부하는 동안 집게를 보존합니다.
2. 원하는 유전자형의 파리를 CO₂로 마취합니다.
3. 집게를 사용하여 파리의 날개를 잡고 차가운 70% 에탄올로 30초 동안 씻은 다음 차가운 PBS로 추가로 30초 동안 씻습니다.
4. 파리를 S2 세포 배양 배지로 채워진 깊은 함몰 우물로 옮깁니다.
5. 동일한 유전자형의 모든 파리에 대해 동일한 절차를 반복하고 조직을 보존할 수 있는 절제할 때까지 저온 S2 세포 배양 배지에 유지합니다.
   메모: 약 30분의 시간 동안 해부할 수 있는 파리의 수만 마취합니다. S2 세포 배양 배지의 배양 시간이 길면 조직이 손상될 수 있습니다.
6. 집게로 파리를 잡고 실체 현미경으로 파리를 S2 세포 배양 배지에 담그십시오.
7. 몸의 나머지 부분에서 머리를 분리하십시오. 시체를 버리고 머리를 S2 세포 배양 배지에 담그십시오. 해부 기간 내내 집게로 머리를 잡는 것이 매우 중요합니다. 머리가 뜨기 시작하면 조직을 손상시키지 않고는 머리를 회수하기 어렵습니다.
8. 한쪽 눈을 뽑아내고 항상 하나 이상의 집게로 머리를 잡고 해부를 시작합니다. 아래 조직이 손상되지 않도록 집게 끝이 망막 바로 아래에 있는지 확인하십시오. 다른 쪽 눈을 뽑고 뇌가 나타날 때까지 큐티클을 제거하기 시작합니다.
9. 조직이 깨끗해 보일 때까지 뇌 주변의 모든 기관 조직과 큐티클을 제거합니다. 최적의 염색 결과를 위해 뇌 주변의 모든 기관 조직을 제거해야 합니다. 이제 티슈를 고정하고 염색할 준비가 되었습니다.
10. 고정 단계 타이밍을 맞추기 위해 PFA 용액으로 옮기기 전에 절개된 모든 뇌를 차가운 S2 세포 배양 배지에 유지합니다.

5. 성인 뇌 염색

1. P10 피펫을 사용하여 분리된 뇌를 실온(RT)에서 PFA 용액으로 옮깁니다. 조직 손상을 방지하려면 해부 후 뇌를 이식할 때 집게를 사용하지 마십시오. 너트레이터에서 200μL PCR 튜브의 모든 단계를 수행합니다.
2. 모든 단계에서 P200 피펫으로 기존 용액을 버리기 전에 뇌가 튜브 바닥에 정착하도록 합니다. 조직을 흡인하지 않고 상층액을 제거하십시오. 빛 노출로부터 조직을 보호하십시오.
3. S2 세포 배양 배지에서 2% PFA 200μL로 1시간 동안 또는 4% PFA에서 30분 동안 뇌를 고정합니다. 재현성을 높이기 위해 시료 간의 고정 시간을 동일하게 유지하십시오.
4. 성인 세뇌 세척액 200μL에 각각 15분씩 3회(또는 그 이상) 세척한 후 200μL의 차단 용액으로 조직을 30분 동안 차단합니다. 차단 용액에서 더 긴 배양 시간이 가능합니다.
5. 총 부피 200μL의 성인 세뇌 세척 용액에 희석된 1차 항체로 4°C에서 하룻밤 동안 뇌를 배양합니다.
   메모: 배양 시간은 사용하는 항체의 유형에 따라 달라질 수 있습니다. 더 긴 배양이 필요할 수 있습니다.
   1. 3개의 MCFO 마커를 라벨링하기 위해 anti-HA(1:500), anti-FLAG(DYKDDDDK epitope)(1:100) 및 anti-V5 1차 항체로 뇌를 배양합니다.
   2. 일반적인 1차 + 2차 조합 대신 1차 직접 접합 항체를 사용할 수 있습니다(예: anti-V5:DyLight 549 (1:200)). 이 경우 직접 접합 항체를 2차 항체로 취급합니다.
      메모: 각 유전자형에 대해 일부 뇌를 대조군으로 유지하여 염색의 특이성을 확인합니다. 1차 항체 배양을 건너뛰고 다음 단계로 바로 이동합니다.
6. 성인 세뇌 세척 용액 200μL에 조직을 1시간 동안 3회 세척하고(3.3단계) 성인 뇌 세척 용액에 희석된 2차 형광단 접합체/1차 직접 접합 항체로 4°C에서 하룻밤 동안 또는 RT에서 4시간 동안 총 부피 200μL
   메모: 적절한 항체의 예: AlexaFluor 488 (1:250), anti-V5:DyLight 549 (1:200) 및 DyLight 647 (1:100) 접합 항체.
7. 성인 세뇌 세척액 200μL에 1시간 동안 뇌를 3회 세척한 다음 4°C에서 하룻밤 동안 또는 RT에서 1-2시간 동안 200μL의 PBS로 최종 세척합니다. PBS의 최종 세척 단계는 Triton X-100의 흔적을 제거하며 최적의 염색 결과를 위해 필요합니다. 유리 커버 슬립에 페이드 방지제를 사용하여 장착 매체에 두뇌를 장착합니다.

6. 이미징을 위한 뇌 장착

1. 가위를 사용하여 이미징 스페이서를 적절한 크기로 자릅니다. 고해상도 현미경 검사의 경우 두 개의 유리 커버슬립 사이에 표본과 이미징 스페이서를 끼웁니다.
   메모: 이미징 스페이서는 얇은(0.12mm 두께) 접착 스페이서로, 유리 커버슬립 또는 현미경 슬라이드에 벗겨져 달라붙어 압축 없이 표본을 장착할 수 있습니다.
2. 집게를 사용하여 한쪽 표면에서 접착 라이너를 제거하고 유리 커버슬립(22mm x 60mm) 표면에 접착면이 아래로 향하게 하여 스페이서를 적용합니다. 10μL의 장착 매체를 새 유리 커버슬립에 적용합니다.
3. P10 피펫을 사용하여 200 μL 튜브의 뇌를 장착 매체 드롭 옆의 커버슬립으로 옮깁니다. 조직과 함께, 용액 상태의 뇌를 유지하기 위해 일부 PBS를 전달합니다.
4. P10 피펫을 사용하여 PBS의 양을 제한하기 위해 PBS에서 장착 매체의 드롭으로 뇌를 이동합니다. 이미징 스페이서를 사용하여 커버슬립의 장착 매체에 있는 표본을 옮깁니다. 시편을 덮을 수 있는 충분한 장착 매체를 사용하십시오.
5. 스페이서 상단에서 다른 접착 라이너를 제거하고 표본 위에 유리 커버슬립을 추가합니다. 집게 끝으로 접착 부위에 부드러운 압력을 가하여 밀봉합니다. 장착된 조직을 즉시 이미지화하거나 나중에 분석할 수 있도록 슬라이드를 -20°C에서 보관하십시오.

결과

그림 1: MCFO 기법에 대한 교차 체계. MCFO 기법의 개략도. MCFO 카세트와 hsp-Flp(hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5)를 운반하는 동형접합 처녀는 특정 동형접합 GAL4 드라이버 수컷과 교배됩니다. 그런 다음 F1 세대는 열 충격을 받습니다. 기자로부터 무작위로 제거된 FRT-stop-FRT 카세트의 수에 따라 7가지 색상이 가능합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
수조	시	GD100
PCR 튜브	사르슈테트	72.737.002
집게	뒤몽	11251-20
해부 접시 30mm x 12mm	전자 현미경 과학	70543-30	유리 해부 접시
파이렉스 3 디프레션 글래스 스폿 플레이트	코 닝	7223-34	유리 해부 플레이트
실가드 블랙	SYLGARD, 시그마 알드리치	805998	숯으로 만든 집
ExpressFive S2 세포 배양 배지	인비트로젠	제10486-025
PFA 20%	전자 현미경 과학	15713
트리톤 X-100	로스	3051.3
노멀 염소 세럼	잭슨 연구소	TEL.005-000-121
일반 당나귀 세럼	잭슨 연구소	TEL:017-000-121
소 세럼 알부민	시그마	A9647
토끼 HA-tag	세포 신호 전달	C29F4	1차 항체, 희석 1:500
쥐 FLAG 태그	Novus 생물학적 제제	NBP1-06712	1차 항체, 희석 1:100
마우스 V5 태그: DyLight 549	애드세로텍	411	접합 항체, 희석 1:200
토끼 방지 AlexaFluor 488	인비트로젠	A11034	2차 항체, 희석 1:250
안티 랫 다이 라이트 647	잭슨 연구소	전화: 712-605-153	2차 항체, 희석 1:100
벡타 쉴드	벡터 연구소	H-1000
슬로우페이트 골드	인비트로젠	S36937
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R86E01-GAL4(ALG)	블루밍턴 스톡 센터	45914	GAL4 드라이버
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