원심분리 보조 미토콘드리아 교모세포종 줄기세포로의 이식

초록

출처: Mombo, B. N., et al. MitoCeption: 고립된 인간 MSC 미토콘드리아를 교모세포종 줄기세포로 이전. J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오에서는 원심분리를 통해 형광 표지된 미토콘드리아를 교모세포종 줄기세포(GSC)로 전달할 수 있는 방법을 보여줍니다. 공여자 미토콘드리아의 성공적인 흡수 및 기능적 통합은 컨포칼 현미경을 사용하여 형광을 검출함으로써 확인됩니다.

프로토콜

1일차

1. 중간엽 줄기 세포(MSC) 미토콘드리아의 표지

1. 미토콘드리아 제제 이틀 전, 100mm 컬트로어 접시에 인간 MSC를 10ml(Minimum Essential Medium Eagle)/FBS(Fetal bovine serum) 10%에 파종하여 1일차에 배양에서 4 x 10⁵ MSC를 갖도록 합니다.
2. MSC를 PBS(4ml)로 헹구고 4ml αMEM/FBS 1%(37°C로 예열)를 추가합니다.
3. 필요한 양의 미토콘드리아 바이탈 염료를 추가하고 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 세포를 배양합니다.
4. 미토콘드리아 염료 용액을 제거하고 예열 된 4ml(37°C) αMEM/FBS 1%로 세포를 두 번 헹구고 4ml αMEM/FBS 10%를 다시 추가합니다. 37°C에서 세포를 배양합니다.
5. 30분 후에 배양 배지(10ml αMEM/FBS 10%)를 변경하고 2시간 후에 다시 변경합니다.

1일차

2. 교모세포종 줄기세포(GSC)의 라벨링

1. poly-HEMA 코팅된 세포 배양 플라스크에서 신경구체로 성장한 GSC Gb4 세포주(10 x 10⁶ 세포)를 해리합니다.
2. GSC 증식 배지(500μl)의 10⁵ cells/well에서 48-well plate에 GSC를 파종합니다(표 1 참조).
3. 플레이트를 270 x g에서 20°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
4. 필요한 양의 세포 바이탈 염료를 추가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
5. 48웰 플레이트의 웰당 500μl의 GSC 기저 배지(표 1)를 추가합니다.
6. 20°C에서 270 x g에서 5분 동안 플레이트를 원심분리하고 상층액을 흡입합니다.
7. 2.5-2.6단계를 반복합니다.
8. 500μl의 GSC 기저 배지를 추가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
9. 20°C에서 270 x g에서 5분 동안 플레이트를 원심분리하고 상층액을 흡입합니다.
10. 48-well 플레이트의 웰당 500μl의 GSC 증식 배지를 추가하고 37°C incubator.
    에서 배양합니다. 메모: 표시된 GSC의 양(10 x 10,⁶ 세포)으로 다양한 용량-반응 실험 및 FACS 대조군을 수행할 수 있습니다. 실험 조건이 보다 정확하게 정의되면 이 양을 줄일 수 있습니다.

3. 교모세포종 줄기세포의 파종

1. GSC(교모세포종 줄기세포) 신경구(10 x 10⁶ 세포)를 50ml 튜브에 20°C에서 270 x g에서 5분 동안 원심분리하여 수집합니다.
2. HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution) 5ml로 세포를 세척하고 20°C에서 5분 동안 270 x g으로 원심분리합니다.
3. 상층액을 흡인합니다.
4. GSC 펠릿을 100μl 트립신-EDTA(에틸렌디아민 테트라아세트산)(0.25%)(10 x 10⁶셀당)에 부드럽게 재현탁합니다.
5. 37°C에서 3분 동안 배양합니다.
6. 10μl CaCl₂(20mM) 및 2μl DNase I(10mg/ml)를 추가합니다.
7. P200 피펫으로 부드럽게 위아래로(30-50x) 피펫팅하여 신경구를 해리합니다. 거품을 피하십시오. 현미경으로 모든 GSC가 해리되었는지 확인합니다.
8. 10μl 트립신 억제제(5%)와 10ml HBSS를 추가합니다.
9. 20°C에서 7분 동안 270 x g의 원심분리기 GSC.
10. 상등액을 버리고 10ml GSC 기저 배지를 첨가합니다.
11. Thoma 계수 챔버로 GSC를 계수한 다음 20°C에서 7분 동안 270 x g에서 세포를 원심분리합니다.
12. 10⁶ GSCs/ml의 세포 농도에 도달하기 위해 적절한 부피의 GSC 증식 배지를 추가합니다.
13. 96웰 플레이트의 웰당 10개의⁵ GSC(세포 현탁액 100μl)를 파종합니다.
14. 20°C에서 7분 동안 270 x g에서 플레이트를 원심분리하여 웰 바닥에 GSC를 얻습니다.
15. 96웰 플레이트를 37°C에서 배양합니다.

2일차

4. MSC(중간엽 줄기세포) 미토콘드리아 분리

1. 마이크로튜브 원심분리기 온도를 4°C로 조정합니다.
2. 미토콘드리아 추출을 위한 시약(200μl 시약 A 및 400μl 시약 C, 둘 다 EDTA-free 프로테아제 억제제를 포함)을 포함하는 두 개의 1.5ml 튜브 "A" 및 "C"를 준비합니다. "MSC" 및 "Mito"라고 표시된 2개의 다른 튜브를 준비합니다. 모든 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 또한 미토콘드리아 연속 희석을 위한 튜브를 준비합니다.
3. MSC를 10ml의 예열된(37°C) PBS(인산염 완충 식염수)로 세척합니다.
4. MSC를 2ml 트립신(EDTA 없음)으로 10초 동안 세척하고 1ml 트립신(EDTA 없음)을 추가합니다. 37°C에서 5-10분 동안 세포를 배양합니다.
5. 10ml αMEM /FBS 10%를 첨가하여 MSC를 회수하고 50ml 튜브에 옮깁니다.
6. 20°C에서 5분 동안 270 x g의 원심분리 셀.
7. 상등액을 버리고 세포 펠렛에 10ml αMEM/FBS 10%를 첨가합니다.
8. Malassez 계수실로 MSC를 계수합니다.
9. 270 x g에서 20°C에서 5분 동안 원심분리기 MSC(4-5 x 10,⁵).
10. 상등액을 버리고 세포 펠렛에 1m 얼음처럼 차가운 αMEM/FBS 10%를 첨가하고 세포를 "MSC" 표지 튜브로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
11. MSC가 들어 있는 튜브를 900 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
12. 튜브에서 모든 잔류 매체를 제거합니다.
13. 200μl의 미토콘드리아 분리 시약 A(EDTA-free 프로테아제 억제제 포함)를 추가합니다. 5초 동안 중간 속도로 소용돌이치고 정확히 2분 동안 얼음 위에 튜브를 그대로 둡니다.
14. 2.5μl의 미토콘드리아 분리 시약 B. Vortex를 10초 동안 최대 속도로 첨가한 다음 튜브를 얼음 위에 둡니다. 30분 동안 5초 간격으로 반복합니다.
15. 200μl의 미토콘드리아 분리 시약 C(EDTA 무함유 프로테아제 억제제 포함)를 추가합니다. 튜브를 기울여 혼합합니다(약 30회, 소용돌이치지 않음). 700 x g에서 튜브를 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
16. 상층액(MSC 미토콘드리아를 함유하고 있음)을 "Mito" 튜브로 옮깁니다.
17. 3,000 x g에서 원심분리기, 4°C에서 15분 동안 원심분리기를 사용하여 미토콘드리아 펠릿을 얻습니다. 상등액을 버리십시오. 펠릿에는 분리된 미토콘드리아가 포함되어 있습니다.
18. 미토콘드리아 펠릿을 200μl의 시약 C로 헹굽니다. 그런 다음 12,000 x g에서 원심분리, 4°C에서 5분 동안 미토콘드리아 펠릿을 얻습니다.

5. 분리된 MSC 미토콘드리아를 GSC로 이전(MitoCeption)

1. MSC에서 분리된 미토콘드리아 펠릿에 예냉각된(0°C) GSC 증식 배지 200μl를 추가합니다(4 x 10,⁵).
2. 미토콘드리아 제제(GSC 증식 배지에서)를 희석하여 GSC에 20μl의 미토콘드리아 현탁액을 일관되게 첨가합니다.
3. 분리된 미토콘드리아의 부피를 원하는 농도(0.1 - 10 μg)로 GSC를 포함하는 96웰 플레이트의 웰에 추가합니다. 미토콘드리아를 우물 바닥 가까이에서 천천히 추가하여 전체 표면을 한 번 이상 덮습니다.
4. MSC 미토콘드리아와 함께 미토콘드리아 수용자 GSC를 포함하는 96웰 플레이트를 1,500 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다.
5. 원심분리 직후 37°C cell incubator에 배양 플레이트를 놓습니다.
   메모: 미토콘드리아 전달 프로토콜은 적절한 원심분리력으로 배양된 세포에 대한 미토콘드리아 현탁액의 원심분리에 의존하며, 미토콘드리아 공여자/수용자 세포의 시스템에 따라 조정될 수 있는 여러 원심분리에 의존합니다.

표 1: 배양 매체.

세포 배양 배지	구성
GSC 기초 매체	DMEM/F-12 보충
	인슐린 20 mg/ml
	N2 보충제 1x
	포도당 3 g/L
	L-글루타민 2mM
GSC 증식 매체	기초 배지에 추가:
	B27 보충제 1x
	EGF 10 ng/ml
	bFGF 10 ng/ml
	펑진 10 mg/ml
	곰팡이 구역 0.25 mg / ml
	헤파린 2 mg /ml
	시프로플록사신 2 μg/ml
	겐타마이신 2 μg/ml
MSC 증식 매체	αMEM이 보충되었습니다.
	L-글루타민 2mM
	10% FBS
	bFGF 2 ng/ml

결과

그림 1: MitoCeption에 의해 분리된 MSC 미토콘드리아를 GSC로 전달하기 위한 워크플로우. MSC 미토콘드리아에서 GSC로의 MitoCeption과 후속 GSC 분석을 위한 7단계가 나와 있습니다. 단계 번호는 프로토콜 섹션과 같이 표시됩니다. MSC 및 GSC 라벨링을 수행하지 않는 경우 기능 분석의 경우 1단계와 2단계를 생략할 수 있으며 2일차부터 프로토콜을 따를 수 있습니다. 위상차 이미지는 Gb4 GSC를 신경구(1일차), MSC 미토콘드리아 전달을 위해 준비된 단세포 배양(2일차), 미토콘드리아 전달 후 24시간(3일차)으로 나타냅니다. 눈금 막대 = 100μm. 4단계에서, MSC에서 분리하기 전에 MitoTracker Red CMXRos로 사전 라벨링된 분리된 MSC 미토콘드리아의 대표...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
조직용 미토콘드리아 분리 키트	피셔 사이언티픽	10579663
N-2 보충제 (100X)	피셔 사이언티픽	11520536
B-27 보충제 W/O VIT A (50X)	피셔 사이언티픽	11500446
HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+	시그마	H4385
폴리 헴	시그마	P3932
	오자임	BE12-169F
글루타민이 없는 DMEM/F-12,	피셔 사이언티픽	11540566
L-글루타민	인비트로젠	25030-024
포도당	시그마	G7021
인슐린	시그마	나 1882
인간 bFGF	R&D 시스템	233-FB-025
인간 EGF	페프로텍	AF-100-15
헤파린	시그마	H3149
CaCl2	머크	2382
트립신 억제제	시그마	T9003
DNase I	시그마	10104159001
트립신 0.25% /EDTA 1 mM	인비트로젠	25200056
트립신	기코	15090-046
프로테아제 억제제 EDTA 무함유	시그마	4693159001
시프로플록사신	시그마	17850-5G-F
펑진	인비보젠	개미-fn-1
곰팡이 구역	써모피셔	15290018
겐타마이신	유로메덱스	EU0410
미토트래커 그린 FM	분자 프로브	M7514
MitoTracker 레드 CMXRos	분자 프로브	M7512
미토트래커 딥 레드 FM	분자 프로브	M22426
셀트래커 그린 CMFDA	분자 프로브	C7025
셀트래커 블루 CMF2HC	분자 프로브	C12881
리파	산타크루즈	사우스캐롤라이나-24948
FluoroDish 멸균 배양 접시	세계 정밀 기기	FD35-100
혈구계	피셔 사이언티픽	267110
FACS 튜브	벡크먼 쿨터	25,23,749
FACS 장치	갈리오스	3L 10C
LC 패스트 스타트 DNA 마스터 플러스	로슈	3515885001

글루타민이 없는 aMEM 위치