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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 작업 솔루션 및 버퍼 준비
참고: 분석 당일 아침에 다음 용액을 준비합니다. 이 계산은 12마리의 생쥐에서 두 개의 뇌 영역(즉, 전전두엽 피질[PFC]과 해마[HPC])을 처리하는 데 필요한 솔루션을 기반으로 합니다.
- 표 1에 언급된 바와 같이 인공 뇌척수액(aCSF, pH = 7.4)을 준비합니다. 각 샘플링 튜브에 750μL의 aCSF를 분배하고 얼음 위의 금속 온도 블록에 넣어 완충액을 사전 냉각합니다.
- 표 2에 언급된 대로 용해 버퍼를 준비합니다. 얼음에 보관하십시오(샘플당 400μL 사용).
- 5mM 구연산나트륨 완충액(pH = 5.0)에 52mM Bis(sulfosuccinimidyl)suberate 또는 BS3 원액(26x)을 준비합니다.
- 먼저 100mM의 구연산(스톡 A)과 100mM의 시트르산나트륨(스톡 B)을 준비합니다.
- 스톡 A와 스톡 B를 탈이온수로 1:20의 비율로 희석합니다. 물 1.9mL에 각각 100μL를 첨가하여 각각 5mM 구연산(스톡 C) 및 5mM 시트르산나트륨(스톡 D)을 준비합니다.
- 410μL의 원액 C와 590μL의 원액 D를 혼합하여 5mM 구연산나트륨 완충액(pH = 5.0)을 준비합니다(용액 E, 1mL).
- pH 지시 스트립을 사용하여 용액 E의 pH를 확인합니다.
- BS3 원액(26x)을 준비하기 위해 30초 동안 볼텍싱하여 용액 E 806.4μL에 BS3 24mg을 용해합니다.
- 비가교결합 샘플에 대한 차량 제어로 사용하기 위해 또 다른 1mL의 용액 E를 준비합니다.
참고: 다른 모든 것이 준비되고 실험이 시작되려고 할 때 BS3 원액을 준비합니다. BS3는 사용할 때까지 4°C에서 건조시켜 보관해야 합니다. 일단 재구성되면 BS3는 약 ≤3시간 동안만 활성 상태를 유지합니다. 5mM 구연산나트륨 완충액(용액 E)의 pH가 시간이 지남에 따라 상승하여 BS3 가수분해가 가속화되는 것으로 보고됨에 따라 용액 E를 원액 A 및 B에서 신선하게 제조하는 것이 좋습니다. 저온에서 BS3의 용해도가 제한되어 있기 때문에 재구성된 BS3는 RT로 유지해야 합니다. 재구성된 BS3를 3시간 이내에 사용하십시오. 재구성된 BS3를 동결/해동하거나 재사용하지 마십시오.
2. 뇌 조직 해부
참고: 이 단계부터는 적어도 두 사람이 협력해야 합니다. 한 사람이 동물 해부에 집중하는 동안 다른 사람은 시간 기록원으로 일하며 분석을 조정하는 데 도움을 주어야 합니다.
- 해부를 위해 첫 번째 동물을 주거 지역에서 해부실로 데려옵니다.
참고: 급성 스트레스 요인(예: 새로운 환경, 피 냄새)이 뇌 단백질 역학에 영향을 미칠 수 있으므로, 동물을 해부 구역에서 멀리 떨어진 가정용 우리에 가둬야 하며, 그 후 즉시 참수할 수 있도록 개별적으로 해부실로 데려와야 합니다.
- 경추 탈구로 쥐를 안락사시킨 후 참수합니다. 두개골에서 뇌를 빠르게 제거하고 페트리 접시에 담근 얼음처럼 차가운 PBS에 10-15초 동안 담급니다(그림 1).
참고: 동물은 BS3 실험을 위해 마취되지 않았는데, 그 이유는 모든 마취제가 신경전달물질 수용체의 표면 제시 수준에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있기 때문입니다.
- 차갑게 식힌 뇌를 얼음 위의 뇌 매트릭스에 넣고 뇌의 복부 쪽이 위를 향하도록 합니다(그림 2).
- 첫 번째 면도날을 후각구와 후각 꽃자루 사이의 경계에 삽입하여 뇌를 관상동맥으로 절단합니다(그림 3). 3-4개의 면도날을 추가로 사용하여 뇌의 앞쪽 부분을 1mm 간격으로 관상동맥으로 연속적으로 절단합니다.
- 삽입된 모든 면도날을 함께 잡고 뇌 기질에 뇌의 뒤쪽 부분을 남겨두어 뇌 기질에서 관상 조각을 들어 올립니다. 집게를 사용하여 면도날을 서로 분리하고 뇌 절편이 위를 향하도록 하여 평평하고 차가운 표면에 놓습니다(그림 4).
- 관심 영역을 포함하는 슬라이스를 식별합니다. PFC를 샘플링하려면 후각 꽃자루를 포함하는 첫 번째 슬라이스 뒤에 있는 두 번째 및 세 번째 슬라이스를 선택합니다.
- 조직 펀치를 사용하여 관심 영역을 제거하고 식힌 면도날에 따로 보관한 다음 조직을 두 개로 고르게 나눕니다(예: 좌반구와 우반구의 조직, 관심 대상 단백질이 양쪽 반구에서 동일하게 발현되는 경우 절반은 BS3 가교 반응에 사용하고 다른 절반은 비가교 대조군에 사용).
- 조직을 으깨거나 갈리는 대신 면도날에 대해 여러 번 수직 동작으로 집게의 미세한 끝을 사용하여 면도날의 각 조직을 조각으로 다집니다. 이것은 세포의 막 무결성을 심각하게 손상시키지 않고 BS3에 접근할 수 있는 표면적을 최대화합니다. 다진 직후 다진 조직을 적절한 튜브로 옮깁니다(3.3단계 참조).
3. 가교 반응
- 이전 쥐의 뇌 해부가 거의 끝날 때 사육 구역에서 해부실로 다음 동물을 데려옵니다(2.10단계).
- 얼음 위에서 미리 냉각된 튜브에 30μL의 BS3 용액(26x) 또는 차량 용액 E를 다진 조직이 적절한 튜브로 옮길 준비가 되기 직전에 스파이크합니다. 가교가 없는 제어 튜브에서 BS3가 오염되지 않도록 튜브 사이의 피펫 팁을 교체하십시오.
- 다진 조직(2.8단계)을 해당 튜브로 옮기고 다음 동물을 해부하기 시작합니다(2.2단계).
- 튜브를 뒤집고 혼합하여 조직 덩어리를 더 작은 조각으로 분해하고 30분에서 2시간 동안 냉장실의 튜브 회전기에서 샘플을 배양하기 시작합니다. 각 튜브에 대한 BS3 배양 시작 시간을 기록합니다. 최적의 배양 시간에 대해서는 논의 섹션을 참조하십시오.
- 튜브에 78 μL의 1 M 글리신을 스파이크하여 반응을 담금질하고 일정한 회전으로 4 °C에서 10분 동안 샘플을 추가로 배양합니다. 각 튜브의 담금질 시작 및 종료 시간을 기록합니다. 다음 동물을 데려오고(3.1단계) 교차결합을 돕음으로써(3.2단계) 동물 해부에 집중하고 있는 사람을 계속 돕습니다.
참고: 모든 샘플에서 각 샘플을 정확히 동시에 처리합니다. 해부실이 냉장실에서 멀리 떨어져 있는 경우, 저장실에서 샘플 배양 및 담금질에 참여할 제3자를 모집하는 것이 좋습니다.
표 1: 인공 뇌척수액의 조성.
포도당
2.5m (250배)
| 작업 conc. | 재고 솔루션 | 분배할 원액의 양 |
| 1.2 mM CaCl2 | 480mM(400배)* | 100 μL |
| 20 mM 헥스 | 1m (50배) | 800 μL |
| 147 mM NaCl | 5m (34배) | 1176.5 μL |
| 2.7 mM KCl | 1.08m(400배) | 100 μL |
| 1 mM MgCl2 | 400mM(400배) | 100 μL |
| 10 mM | | 160 μL |
| 탈이온수 | | 37.563 mL |
| 합계 | | 40mL |
| * CaCl2 스톡은 실험 당일에 새로 준비해야 합니다. |
표 2: 용해 버퍼의 조성
| 작동 conc. | 재고 솔루션 | 분배할 원액의 양 |
| 25 mM 헤페스 | 1m (40배) | 500 μL |
| 500mM NaCl | 5m (10배) | 2 mL |
| 2 mM EDTA | 0.5m(250배) | 80 μL |
| 1mM DTT | 1 m (1000배) | 20 μL |
| 0.1% NP-40 | 10% (100배) | 200 μL |
| 프로테아제 억제제 칵테일 | 100배 | 200 μL |
| 탈이온수 | | 17 mL |
| 합계 | | 20mL |
