상향 조절된 포도당 대사를 가진 초파리 유충의 운동 뉴런에서 포도당 흡수 평가

초록

출처: Loganathan, S., et al., TDP-43 단백병증 모델 초파리 모델에서 포도당 흡수 측정. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 기반 세포 내 포도당 센서를 사용하여 초파리 애벌레 운동 뉴런의 포도당 흡수를 측정하는 기술을 보여줍니다. 유충을 해부하여 복부 신경삭을 노출시킨 후, 센서의 공여체 형광단에서 방출되는 형광을 통해 운동 뉴런을 시각화합니다. 포도당으로 자극되면 센서의 공여자와 수용체 형광단 사이의 FRET는 수용체에서 형광 방출을 유발하여 상향 조절된 포도당 대사를 가진 대조군 유충과 돌연변이 유충 사이의 포도당 흡수를 비교할 수 있습니다.

프로토콜

1. 초파리 복부 신경삭(VNC) 절제술

1. 실리콘 엘라스토머 해부 접시를 만드십시오.
   1. 제조업체의 프로토콜에 표시된 대로 실리콘 엘라스토머 성분을 50mL 튜브에 붓고 잘 저어줍니다.
   2. 35mm 조직 배양 접시에 약 2mL의 엘라스토머 혼합물을 채웁니다. 주사기를 사용하여 거품을 제거하십시오. 접시를 덮고 60°C 오븐의 평평한 표면에 밤새 놓아 경화시킵니다.
2. 조직 생존력을 유지하면서 VNC를 노출시키기 위해 Drosophila 유충을 해부합니다.
   1. 떠돌이 세 번째 instar 유충을 모아 ddH₂O로 헹군 다음 헤몰림프와 같은 3(HL3) 완충액(70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM 수크로오스, 5 mM 트레할로스, 5 mM 하이드록시에틸피페라진 에탄 술폰산[HEPES]; pH 7.1)을 엘라스토머가 늘어선 접시에 넣습니다.
   2. 해부 현미경으로 한 쌍의 집게(#5 또는 55 집게)를 사용하여 유충 등쪽 앞쪽과 뒤쪽 끝을 위로 고정하고 곤충 핀(Minutein Pins)으로 유충을 세로로 조심스럽게 늘립니다.
   3. 각진 홍채 가위를 사용하여 뒤쪽 핀 바로 위를 절개합니다. 절개 부위에서 시작하여 유충의 앞쪽 끝을 향해 수직 절단을 합니다.
   4. 필요한 경우 HL-3 버퍼 몇 방울을 추가합니다. 중추신경계(CNS)를 방해하지 않고 기관과 나머지 부유 기관을 제거합니다. 신경근 시스템(VNC, 축삭 및 신경근 접합부)을 그대로 유지하면서 CNS를 노출시키기 위해 체벽을 늘리는 플랩을 고정합니다.

2. 이미지 획득

1. 이미징 매개변수를 최적화합니다.
   1. 해부를 시작하기 전에 현미경과 레이저를 켜십시오. 이미지는 40x 침수 렌즈가 있는 정립 컨포칼 현미경을 사용하여 획득해야 합니다. 405nm 레이저를 사용하여 청록색 형광 단백질(CFP)을 여기시키고 CFP(465-499nm) 및 FRET(535-695nm) 검출 채널 모두에서 이미지를 획득합니다.
   2. 스캔 속도(6), 평균(2), 대물렌즈(40x), 확대/축소(1x), 핀홀 크기(1AU) 및 공간 해상도(512 x 512)와 같은 획득 매개변수를 최적화합니다. 신호가 최적의 다이내믹 레인지에 있도록 게인을 조정합니다. 모든 유전자형에 대해 동일한 매개변수를 사용해야 합니다.
2. VNC 내의 운동 뉴런을 이미지화합니다.
   1. 절개된 샘플이 담긴 실리콘 접시를 렌즈 아래에 놓습니다. 렌즈가 트레할로스-슈크로오스 HL3 완충액과 접촉하도록 렌즈를 내립니다. 렌즈가 버퍼에 완전히 잠겼는지 확인하는 것이 중요합니다. 필요한 경우 버퍼를 더 추가합니다.
   2. CFP 및 FRET 채널을 사용하여 VNC 정중선을 따라 위치한 초점이 맞춰진 최소 6개의 운동 뉴런으로 구성된 광학 섹션을 수동으로 선택합니다. 운동 뉴런은 포도당 센서의 발현과 전후 축을 따른 위치에 따라 식별됩니다.
   3. 10초 간격으로 10분 동안 이미지를 획득합니다. 이러한 이미지는 기준선을 나타냅니다.
3. 포도당이 보충된 HL-3로 자극합니다.
   1. 파스퇴르 피펫을 사용하여 HL3-완충액을 함유하는 트레할로스-수크로스를 제거하고 5mM 포도당이 보충된 HL-3(70mM NaCl, 5mM KCl, 20mM MgCl₂, 10mM NaHCO₃, 115mM 수크로스, 5mM 포도당, 5mM HEPES, pH 7.1)로 교체합니다. 이 단계는 VNC의 움직임을 최대한 피하기 위해 세심한 주의를 기울여 수행해야 합니다.
   2. 다시 10분 동안 10초마다 이미지를 획득합니다. 이 이미지는 자극 단계를 나타냅니다.
4. 이미지를 .czi 파일 또는 이미징 소프트웨어에서 지원하는 파일 형식으로 날짜, 유전적 배경, 실험 조건(기준선 또는 자극) 및 사용된 채널을 포함하는 파일 이름으로 저장합니다.
5. 매개변수를 재사용하여 모든 유전자형을 이미지화합니다(그림 1A).

결과

그림 1: TDP-43 돌연변이와 관련하여 포도당 센서의 이미지 분석. (A) 기준선 및 자극 조건에서 포도당 센서 제어 및 TDP-43^G298S 샘플의 FRET 및 CFP 신호의 대표 이미지. 대표적인 운동 뉴런은 ROI의 예로 각 이미지에 요약되어 있습니다. 스케일 바: 20μm. 배율: 40x. (B) 이미징 20분 동안 포도당 센서와 TDP-43 돌연변이 운동 뉴런에서 FRET/CFP의 평균 비율. 비율은 각 유전자형에 대한 평균 기준선 비율로 정규화되었습니다(프로토콜의 기준선 정규화 참조). 표시된 값은 유전자형당 5개의 VNC에서 25-30개의 운동 뉴런(ROI)의 평균입니다. Mann-Whitney는 통계적 유의성을 평가...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
35mm 조직 배양 접시	시그마 알드리치	CLS430165
40X 침수 렌즈	자이스	제440090	담글 수 있는, N.A. 0.8
해부 가위	로보즈	RS-5618
Dumont #5 겸자	폭스바겐	제100189-236
Dumont #55 겸자	폭스바겐	제100189-244
Minutien 핀	Fine Science 도구	26002-10	해부에 사용
SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트	다우	1317318
Zeiss LSM880 NLO 정립 다광자/컨포칼 현미경	자이스	해당 사항 없음

호 호 호 년