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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 면역 염색
참고: 약 100rpm으로 설정된 오비탈 플랫폼 쉐이커에서 모든 세척 및 배양을 수행합니다. 4°C에서 수행되는 1차 항체 배양을 제외한 모든 단계는 실온에서 수행됩니다. 50mL 튜브에 성분을 결합하고 밤새 배양기에서 혼합하여 미리 장착 배지를 준비합니다. 빛을 피하고 4°C에서 최대 2개월 동안 보관하십시오. 내인성 형광 신호가 면역 염색 없이 이미징 및 분석에 충분한 경우 1.1-1.9단계를 건너뛸 수 있습니다. 면역염색을 건너뛸 경우 TBS에서 10분 세척을 3회 수행하고 1.10단계로 진행합니다.
- 50mL 튜브에 10% Triton-X 1mL를 넣고 튜브에 1x TBS를 50mL에 채워 TBST(TBS 내 0.2% Triton)의 새로운 용액을 준비합니다. 각 뇌에 대해 2mL의 차단 및 항체 용액(TBST의 경우 10% 염소 혈청)을 준비합니다.
메모: 최상의 결과를 얻으려면 각각의 새로운 염색 실험에 대해 새로운 TBST를 만들고 10% 수성 Triton-X(Table of Materials)의 고품질 공급원을 사용하십시오.
- 회로도에 따라 24웰 플레이트에 레이블을 지정합니다(그림 1). 다른 행에 다른 샘플을 배치하고 다른 열에 다른 솔루션을 배치합니다. 처음 3개 컬럼('Wash 1', 'Wash 2' 및 'Wash 3')에 TBST 1mL를 추가합니다. 네 번째 컬럼에 차단 용액 1mL를 추가합니다.
- 분젠 버너를 사용하여 5.75 파스퇴르 피펫의 끝을 작은 고리에 녹여 유리 픽을 준비합니다. 이 픽을 사용하여 12웰 플레이트의 조직 절편을 24웰 플레이트의 Wash 1 컬럼으로 옮깁니다.
메모: 최상의 결과를 얻으려면 염색을 시작하기 전에 단면을 스크리닝하십시오. 절편을 스크리닝하려면 1x TBS로 채워진 페트리 접시에 절편을 하나씩 옮기고 5x 또는 10x 대물렌즈가 있는 형광 현미경을 사용하여 절편을 검사하여 적절한 수의 형광 표지된 세포가 존재하는지 확인합니다. 웰당 4-6개의 섹션을 염색하는 것이 좋지만, 필요한 경우 웰당 최대 8개의 섹션을 염색할 수 있습니다.
- Wash 1, 2, 3 웰에서 각각 10분 동안 섹션을 세척한 다음 차단 용액에서 1시간 동안 배양합니다. 유리 픽을 사용하여 한 웰에서 다음 웰로 섹션을 옮깁니다. 픽은 한 번에 여러 뇌 섹션을 전송하는 데 사용할 수 있습니다.
- 각 샘플에 대해 1mL의 기본 항체 용액을 준비합니다(예: Rabbit RFP 1:2000 또는 Chicken GFP 1:2000). 항체 용액에 항체를 첨가하고 잠시 와류를 일으킨 다음 4°C에서 ≥ 4,000 x g로 5분 동안 원심분리합니다.1차 항체의 절편을 4°C에서 2-3박 동안 흔들면서 배양합니다.
- 1차 항체 배양 후 세척 웰에서 Day 1 TBST를 흡인하고 각 세척 웰에 새로운 TBST 1mL를 추가하고 섹션을 첫 번째 세척 웰로 이동합니다. 섹션을 각각 3분 동안 10회 세척합니다.
메모: 흡인을 위해 튜브와 진공 플라스크에 연결된 9인치 파스퇴르 피펫을 사용하십시오. 가정용 진공 라인 또는 전기 진공 펌프를 진공 소스로 사용할 수 있습니다.
- 절편을 세척하는 동안 항체 용액에 항체를 첨가하여 1:200 농도의 2차 항체 용액을 준비합니다(예: 염소 항토끼 594 또는 염소 항닭 488). 잠시 소용돌이 한 다음 4 ° C에서 ≥ 4,000 x g에서 5 분 동안 회전합니다.
- 실온에서 3시간 동안 2차 항체의 절편을 배양합니다. 이 단계와 다음 모든 단계에서 빛으로부터 섹션을 보호하여 2차 항체의 백화를 완화합니다.
- 2차 항체 배양 후 세척 웰에서 Day 2 TBST를 흡인하고 각 세척 웰에 새로운 TBST 1mL를 첨가하고 섹션을 첫 번째 세척 웰로 이동합니다. TBST에서 각각 3분 동안 섹션을 10번 씻습니다.
- 최종 세척 중에 장착 매체를 4°C에서 꺼내 실온으로 데우십시오. 2x TBS: 증류수를 1:1 혼합물로 준비하여 페트리 접시에 넣습니다. 표면에 800μL의 2:1 TBS:dH2O를 추가하여 현미경 슬라이드를 준비합니다.
메모: 비경화 장착 매체를 사용하는 것이 좋습니다. 마운팅 배지를 경화하면 조직의 부피가 변경되어 성상세포 영역 부피 분석에 혼란을 줄 수 있습니다. 간단하고 저렴한 수제 장착 매체에 대한 레시피는 재료 표에 나와 있습니다.
- 가는 붓을 사용하여 Wash 3 웰에서 페트리 접시로 섹션을 한 번에 하나씩 옮깁니다. 이 단계는 트리톤을 제거하고 단면을 평평하게 만드는 데 도움이 됩니다. 다음으로, 페트리 접시의 섹션을 슬라이드의 액체로 옮깁니다.
- 붓을 사용하여 슬라이드에서 평평하게 섹션이 정렬되도록 합니다. P1000 피펫으로 슬라이드에서 과도한 액체를 조심스럽게 제거한 다음 진공 흡입을 수행합니다.
메모: 진공 흡입을 보다 세밀하게 제어하기 위해 파스퇴르 피펫 끝에 P200 피펫 팁을 추가합니다.
- 슬라이드에서 여분의 액체가 모두 제거되면 전사 피펫을 사용하여 즉시 각 섹션에 장착 매체 한 방울을 추가하고 슬라이드 위에 커버 슬립을 부드럽게 놓습니다. 장착 매체가 몇 분 동안 퍼지도록 한 다음 진공 흡입으로 커버슬립 아래에서 나오는 여분의 장착 매체를 제거합니다.
메모: 장착 매체를 추가하기 전에 섹션이 건조되지 않도록 하십시오. 장착 매체를 추가하기 전에 절편이 건조되기 시작하면 조직 부피에 영향을 미치고 정확한 데이터 수집을 방해할 수 있습니다.
- 커버슬립의 네 모서리를 모두 투명한 매니큐어로 밀봉합니다. 슬라이드를 실온에서 30분 동안 건조시킨 다음 4°C에서 평평하게 보관하십시오. 이미징하기 전에 최소 2시간 동안 기다리거나 다음 날 이미지를 만드십시오.
참고: GFP(녹색 형광 단백질) 및 RFP(적색 형광 단백질)에 대한 항체로 염색된 절편은 매니큐어로 완전히 밀봉된 경우 이미징 전에 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.
