인간 사후 소뇌 조직에서 Purkinje 세포를 분리하기 위한 레이저 캡처 미세해부

초록

출처: Martuscello, R. T., L. et al., 인간 사후 소뇌에서 레이저 캡처 미세절부 Purkinje 세포에서 고품질 RNA 분리를 위한 스테인리스 프로토콜. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 레이저 캡처 현미해부를 사용하여 인간 사후 소뇌 조직에서 Purkinje 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 조직 절편

1. 절편을 위해 작은 조직 조각(~1cm x 1cm)을 자릅니다. 남은 티슈는 드라이아이스/-80°C 냉동고에 다시 넣으십시오.
   참고: 조직 부분이 Purkinje 세포가 위치한 ~95% 소뇌 피질인지 확인하십시오.
2. '척'을 덮기 위해 약 3mm 높이의 OCT 마운드를 놓습니다. 작은 마운드가 생길 때까지 천천히 원을 그리며 맨 위에 레이어를 쌓는 것으로 시작합니다.
3. OCT가 부분적으로 얼었지만 여전히 중앙에 약간의 액체가 남아 있으면 그 위에 조직을 놓습니다. 조직을 OCT 깊숙이 밀어 넣지 마십시오. 완전히 얼 때까지 조직을 그 위에 올려 놓으십시오. 이 작업은 1-2분 정도 소요됩니다.
4. 냉동 OCT가 있는 '척'과 조직을 저온 유지 장치 절단 암에 넣습니다. 절단 날과 같은 높이가 되도록 조직을 조정합니다.
5. 조직을 절단 암에 15-20분 동안 두어 새로운 온도에 적응하도록 합니다.
   참고: 조직의 두께에 따라 온도 적응에 시간이 필요합니다. 깨끗하게 절단하는 데 필요한 만큼 조직을 그대로 두십시오. 조직 온도 적응을 돕기 위해 OT 및 CT를 조정합니다.
6. 조직을 칼날에 더 가깝게 천천히 움직입니다. 조직이 칼날에 도달하면 트림 프로세스를 시작합니다. 트림 두께는 30μm로 설정해야 합니다.
7. 피질 층이 보일 때까지 2-3배 자릅니다.
8. 저온 유지 장치 블레이드 바로 위에 안티롤 플레이트를 놓고 정렬합니다.
   참고: 블레이드와 안티롤 플레이트의 계면에 있는 저온 유지 장치의 빛에서 은색 선이 나타납니다. 이것은 안티롤 플레이트가 블레이드 가장자리 바로 위에 있음을 나타냅니다.
9. 14μm에서 단면을 절단하기 시작합니다. 적절하게 절단된 부분은 안티롤 플레이트 아래에 평평해집니다.
   참고: 티슈가 끼어 있으면 안티롤 플레이트가 충분히 차가운지 확인하십시오. 필요한 경우 드라이아이스 한 조각을 바깥쪽(무대에 닿지 않는 면)에 놓으면 안티롤 플레이트가 빠르게 냉각됩니다.
10. 4-6개의 절편을 자르고 저온 유지 장치 단계를 가로질러 수평으로 정렬합니다.
11. 슬라이드를 비스듬히 움직여 한 번에 모든 조직 조각을 집어 올립니다.
    참고: 브러시를 사용하여 티슈 끝을 들어 올려 집었을 때 슬라이드에 더 쉽게 사용할 수 있도록 합니다. 한 번에 한 섹션씩 집어 올리지 마십시오. 실온의 공기에 노출되면 RNA 무결성이 저하됩니다.
    주의: 멤브레인이 저온 유지 장치의 단계에 닿지 않도록 하십시오. 멤브레인이 스테이지에 닿으면 유리 슬라이드에서 분리되기 시작하고 LCM을 시도할 때 오류가 발생합니다.
12. 즉시 6단계로 이동합니다. 고정을 지연하지 마십시오.

2. 티슈/염색 없는 시각화 수정

1. 즉시 에탄올 고정 프로토콜로 이동
2. 얼음 위에 70% 에탄올이 함유된 슬라이드 홀더에 슬라이드를 2분 동안 놓습니다.
3. 얼음 위에서 95% 에탄올이 함유된 슬라이드 홀더에 슬라이드를 45초 동안 놓습니다.
4. 100% 에탄올이 포함된 슬라이드 홀더에 슬라이드를 RT로 2분 동안 놓습니다.
5. 슬라이드 홀더에 자일렌 1로 슬라이드를 3회 담그십시오 — RT.
6. 크실렌 2가 있는 슬라이드 홀더에 슬라이드를 5분 동안 놓습니다(RT.
).
7. 깨끗한 곳에서 최소 30분 동안 건조시킵니다. 건조 시간은 최대 60분으로 연장하는 것이 가장 좋습니다.
   주의: 흄 후드에서 건조하기 위해 스탠드업 슬라이드를 사용하십시오. 크실렌은 휘발성입니다. 슬라이드를 평평하게 놓으면 자일렌이 조직 섹션에 고여 조직이 너무 어두워집니다.

3. 사용을 위해 저장된 슬라이드 해동

1. 사용 1시간 전에 -80°C 냉동고에서 단일 슬라이드로 튜브를 제거합니다.
2. 튜브를 즉시 열지 마십시오. 튜브가 실온에 오도록 합니다. 결로는 튜브 외부에서만 발생합니다.
3. 튜브가 실온에 도달하고 모든 응결이 사라지면(약 30-40분) 캡을 제거하고 슬라이드를 실온의 공기에 노출시킵니다.
4. 슬라이드가 15-20분 동안 실온에 적응하도록 합니다. 그런 다음 캡을 제거한 상태로 튜브 안에 그대로 두십시오.
   참고: 이제 슬라이드가 LCM에 사용할 준비가 되었습니다.

4. Purkinje 세포의 레이저 캡처 미세 해부:

참고: 이 프로토콜 섹션에서는 후속 RNA 염기서열 분석을 위해 Purkinje 세포를 캡처하는 것과 관련된 세부 사항만 논의합니다. 이 섹션에서는 사용자가 UV 레이저 캡처 현미경 및 관련 소프트웨어에 익숙하다고 가정합니다.

1. RNase 오염 제거기로 현미경 스테이지와 캡 수집 암을 청소합니다.
2. 장갑을 낀 손으로 슬라이드를 현미경에 놓고 500μL 불투명 캡을 채취 암에 놓습니다.
   참고: 항상 RNase 오염 제거기로 작업 영역을 청소하고 슬라이드 또는 불투명 캡을 만진 상태에서 장갑을 낀 손을 사용하여 적절한 RNA 기술을 확인하십시오. 슬라이드와 캡이 제자리에 있고 레이저 캡처가 시작되면 장갑을 제거할 수 있습니다.
3. 낮은 배율에서는 불투명한 캡을 소뇌 조직 위에 정렬하여 캡이 접안렌즈에서 시각화된 전체 영역을 덮도록 합니다.
   참고: 불투명 캡이 중앙에 있는 경우 현미경의 접안렌즈만 표시됩니다. 캡이 조직 중앙에 있으면 카메라가 표시되지 않습니다. 레이저 캡처 스코프 설계에 따라 불투명 캡을 통한 시각화는 접안렌즈에만 적용되거나 접안렌즈와 카메라 모두에서 시각화됩니다.
4. 5x - 10x 대물 렌즈로 소뇌층을 시각화하고 분자층과 과립 세포층이 교차하는 부분(Purkinje 세포층) 위에 커서를 놓습니다.
5. 40X로 이동하여 Purkinje 세포를 시각화합니다.
   참고: 시각화의 예는 그림 1 및 그림 2를 참조하십시오.
6. Purkinje 세포 캡처를 시작합니다.
   참고: RNA 염기서열분석을 수행하려면 최소 5ng의 RNA가 필요합니다. 약 1600-2000 개의 Purkinje 세포는 염기서열 분석을 위한 충분한 RNA 물질을 생성합니다. RNA는 현미경에서 최대 8시간 동안 안정적입니다. 포집 전에 UV 에너지와 UV 초점을 테스트하여 수준이 올바른지 확인하십시오. 시간이 지남에 따라 조직은 계속 건조해지고 UV 에너지와 UV 초점을 변경해야 할 수도 있습니다.

결과

그림 1: 소뇌층과 Purkinje 세포 시각화(자일렌 처리 유무). 에탄올 고정 및 탈수 후 자일렌이 있거나 없는 대표 이미지. 분자층(ML)과 과립 세포층(GCL)이 표시되어 있습니다. Purkinje 셀은 화살표로 표시됩니다. (A) 자일렌이 없는 소뇌층 시각화의 5X 표현. 눈금자: 10 μm. (B) 자일렌을 사용한 소뇌층 시각화의 5X 표현. 스케일 바: 10 μm. (C) 자일렌이 없는 소뇌층 시각화의 40X 표현. 스케일 바: 1 μm. (D) 크실렌을 사용한 소뇌층 시각화의 40X 표현. 눈금 막대: 1μm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
멤브레인슬라이드 NF 1.0 PEN	자이스	415190-9081-000	조직을 위한 멤브레인 슬라이드. 유리 슬라이드는 사용하지 않는 것이 좋습니다.
AdhesiveCap 500 불투명	자이스	415190-9201-000	불투명 캡은 반전된 스코프에서만 시각화를 향상시키는 데 사용됩니다.
RNase 어웨이	분자 바이오 제품	7005-11	다른 RNase 오염 제거 제품도 적합합니다. 작업하기 전에 모든 표면을 청소하는 데 사용하십시오.
200 프루프 에탄올	데콘 연구소	2701	대체 에탄올을 사용하는 경우 고품질을 보장하십시오. 조직 고정에 필수적입니다.
자일렌(Certified ACS)	피셔 사이언티픽	엑스5P-1GAL	대체 크실렌을 사용하는 경우 고품질을 보장하십시오. 조직 시각화에 필수적입니다.
UltraPure 증류수	인비트로젠	제10977-015	다른 RNA/DNA/Nuclease 자유 물도 적합합니다. 에탄올 희석에만 사용됩니다.
슬라이드 수정 슬라이드 항아리	상록	240-5440-G8K	모든 슬라이드 홀더/항아리도 적합합니다. 사용하기 전에 청소해야 합니다. 단면 후 고정에 사용됩니다.
안티 롤 플레이트, Assy. 70mm 100um	라이카 바이오시스템즈	14041933980	안티롤 플레이트 유형은 저온 유지 장치의 유형과 스테이지의 부착 위치에 따라 결정됩니다. 모든 저온 유지 장치에는 요구 사항이 다릅니다.
킴와이프	피셔 사이언티픽	06-666ᅡ	Kimwipes는 모든 공급업체에서 주문할 수 있으며 모든 크기에서 사용할 수 있습니다. Kimwipes는 현미경과 저온 유지 장치를 청소하는 데 사용됩니다.
Tissue-Plus O.C.T. 컴파운드	피셔 사이언티픽	제23-730-571	OCT의 모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. OCT에는 어떤 조직도 삽입되지 않으며 '척'에 조직을 부착하는 것은 간단합니다.
Edge-Rite 로우 프로파일 마이크로톰 블레이드	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	4280엘	블레이드 유형은 저온 유지 장치의 유형에 따라 결정됩니다. 모든 저온 유지 장치에는 요구 사항이 다릅니다.
라이카 마이크로시스템즈 3P 25 + 30MM 크라이오스탯 척	피셔 사이언티픽	NC0558768	척 유형은 저온 유지 장치의 유형에 따라 결정됩니다. 모든 저온 유지 장치에는 서로 다른 요구 사항이 있습니다. 두 크기 모두 적합합니다.