다운스트림 분석을 위한 마우스 뇌 처리

Abstract

출처: Wager-Miller, J. et al.다운스트림 분석을 위한 동결된 설치류 뇌 영역 수집. J. Vis. 특급 (2020)

이 동영상은 다운스트림 분석을 위해 동결된 마우스 뇌 조직 절편을 준비하기 위한 자세한 단계별 프로토콜을 보여줍니다.

Protocol

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 뇌 저장

1. 기존 방법을 사용하여 약 30g의 무게가 나가는 안락사된 성인 CD1 야생형 마우스의 뇌를 신속하게 제거하고 드라이아이스로 미리 냉각된 액체 질소 또는 이소펜탄에서 60초 동안 급속 동결합니다.
2. 냉동 뇌는 사용할 때까지 알루미늄 호일 또는 원추형 튜브에 -80 ° C에서 보관하십시오.

2. 뇌 매트릭스 준비

1. 조직을 해부하기 24시간 전에, 깨끗한 뇌 매트릭스를 해동된 냉동 팩 더미에 올려 놓는다. 두 개의 냉동 팩 사이에 매트릭스의 측면을 끼우고 면도기 슬롯 바닥과 젤 팩 상단 사이에 약 0.5cm를 남겨 둡니다(그림 1A). 냉각을 돕기 위해 끝에 알루미늄 호일을 놓습니다.
   참고: 뇌 매트릭스를 구입할 때는 해부할 뇌의 전체 부피를 둘러쌀 수 있을 만큼 충분히 큰 매트릭스를 구입하십시오.
2. 뇌 매트릭스와 냉동 팩이 들어 있는 상자를 -20°C 냉동고에 넣고 상단을 밤새 열어 둡니다.

3. 얼어붙은 유리판 설정하기

참고: 이 설정의 목적은 뇌 단면을 해부하기 위해 얼어붙은 표면을 준비하는 것입니다.

1. 단열 상자에 얼음을 상단에서 최대 약 5cm 떨어진 곳에 놓습니다. 그런 다음 얼음 위에 2.5cm의 드라이아이스 층을 놓고 검은색 플라스틱 시트로 덮어 샘플을 시각화하는 데 도움이 됩니다(그림 1B, 그림 1C).
2. 플라스틱 위에 유리판(상자 입구에 딱 맞아야 함)을 놓고 플레이트 상단의 먼 모서리에 드라이아이스를 놓습니다(그림 1C).
3. 냉동실에서 얼어붙은 뇌 매트릭스를 꺼내 절단할 뇌를 피질이 위로 향하게 삽입합니다. 10분 동안 상자의 온도와 평형을 이룰 때까지 기다립니다. 이 시간 동안 상자의 뚜껑을 닫으십시오.
4. 차가운 집게로 매트릭스에서 뇌의 위치를 조정하여 시상동과 횡동이 블록의 수직 홈과 정렬되도록 합니다(그림 1D). 이렇게 하면 더 쉽게 해부할 수 있도록 대칭 단면을 보장하는 데 도움이 됩니다. 뇌를 조정하기 전에 집게 끝을 만져 드라이아이스를 잠시 식히십시오.
5. 뇌가 제 위치에 놓이면 식힌 면도날을 중앙 근처에 놓고 면도날을 조직 안으로 약 1mm 누릅니다. 뇌를 제자리에 고정하는 데 도움이 되도록 주위와 꼬리 끝에 차가운 칼날을 추가합니다(그림 2A 및 그림 2B).
6. 로스트랄 끝에서 시작하여 한 번에 하나씩 블레이드를 추가하여 슬롯에 넣고 약 1mm 정도 조직에 부드럽게 누릅니다(그림 2B). 꼬리 끝을 향해 1mm 간격으로 블레이드를 계속 추가합니다.
7. 이 시간 동안 뇌가 움직이지 않도록 하십시오. 블레이드를 수평 및 수직으로 정렬합니다(그림 2B). 로우 프로파일 마이크로톰 블레이드를 사용하여 단면을 0.5mm 너비로 절단할 수 있습니다. 더 큰 면도날 사이에 놓습니다(그림 2C).
8. 블레이드가 제자리에 놓이면 손가락, 손바닥 또는 기타 평평한 표면으로 그룹 상단을 누릅니다(그림 2C, 그림 2D). 칼날 그룹을 좌우로 천천히 흔들어 조직 사이로 이동합니다.
   메모: 이 작업은 다소 시간(1-2분)이 걸릴 수 있으며 인내심이 필요합니다. 조직을 통해 이동하는 블레이드에 대한 저항이 있어야 합니다. 쉽게 들어갈 수 있다는 것은 뇌가 녹고 있으며 블록은 드라이아이스로 냉각되어야 한다는 것을 의미합니다.
9. 모든 블레이드가 슬롯 바닥에 도달하면 블레이드 그룹의 양쪽을 잡고 앞뒤로 흔들어 매트릭스에서 벗어나도록 작업합니다.
   메모: 칼날의 날카로운 모서리에 베이지 않도록 주의하십시오.
10. 그룹이 자유로워지면 유리판 위에 스택을 올려 놓습니다(그림 2E). 드라이아이스를 스택 옆 및/또는 위에 놓아 샘플을 더 얼려 쉽게 분리할 수 있습니다.
11. 날카로운 모서리가 있는 스택을 유리판에 놓고 엄지 손가락과 손가락 사이로 스택을 이동하여 블레이드를 분리합니다. 블레이드는 섹션이 부착된 상태로 서로 분리되어야 합니다.
12. 유리판의 부분을 주부에서 꼬리부까지 정렬합니다(그림 2F).
13. 손가락 사이로 칼날을 구부리거나 두 번째 차가운 면도기로 분리하여 칼날에서 조직을 분리합니다(그림 2G, 2H, 2I).

4. 섹션 해부

1. Allen Mouse Brain Atlas 또는 다른 참조 자료를 열고 관심 영역을 식별하는 데 필요한 랜드마크를 찾습니다. 몇 가지 명백한 랜드마크에는 anterior commissure, corpus callosum, lateral ventricles 및 hippocampus가 포함됩니다(그림 3).
2. 식힌 집게로 절단할 부분을 뒤집고 수집할 영역이 전체적으로 일정한지 확인합니다. 수확하는 동안 참조 아틀라스를 자주 참조하여 올바른 ROI를 얻었는지 확인하십시오.
   참고: 돋보기 또는 해부 현미경이 이 과정에서 도움이 되는 경우가 많습니다. 적절한 조명도 필수적입니다. 낮은 와트tage LED 램프 또는 멋진 램프를 이러한 목적으로 사용할 수 있습니다.
3. 깨끗한 메스나 펀치로 해당 부분을 자릅니다(그림 4). 절단하기 전에 각 도구를 드라이아이스에 짧게 터치하여 미리 식히십시오. 칼날을 부드럽지만 단단히 조직에 밀어 넣고 앞뒤로 흔들어 절단합니다. 너무 세게 밀지 마십시오. 그렇지 않으면 조직이 골절될 수 있습니다.
   알림: 도구는 시간이 지남에 따라 따뜻해집니다. 약간 데워진 칼날은 깨끗하게 절단하고 골절을 제한하는 데 도움이 될 수 있지만 조직이 해동되지 않도록 주의하십시오. 드라이 아이스에서 주기적으로 도구를 식히십시오.
4. ROI가 수확되면 라벨이 부착되고 사전 냉각된 1.5mL 튜브에 넣습니다. 수확한 조직은 필요할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.

Results

그림 1: 얼어붙은 작업 표면 준비. (A) 뇌 블록은 단열 상자 안의 젤 팩 더미에 놓인 다음 두 개의 추가 젤 팩 사이에 끼워집니다. 알루미늄 호일은 구획 도중 냉각을 쉽게 하기 위하여 구획의 각 끝에 포장됩니다. 그런 다음 상자를 -20 °C에서 밤새 냉각합니다. (B) 유리판은 절연 상자의 개구부와 크기에 맞게 일치합니다. 이를 위해 배송 상자를 사용할 수 있습니다. 위에서 약 5cm 떨어질 때까지 상자에 얼음을 넣습니다. 그런 다음 상자를 -20 °C에서 밤새 얼립니다. (B, C) 조직을 채취하기 직전에 약 2.5cm 깊이의 얼음 위에 드라이 아이스의 균일한 층을 놓습니다. 검은색 플라스틱 한 장(시각화를 돕기 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5mm 마우스 관상 뇌 매트릭스	브레인트리 사이언티픽	BS-SS 505C	커팅 블록
0.5mm 쥐 코로나 뇌 매트릭스	브레인트리 사이언티픽	BS-SS 705C	절단 블록
플런저가 있는 1.0mm 바이옵시 펀치	전자 현미경 과학	69031-01
1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브	닷 사이언티픽	229443	동결된 ROI 저장용
플런저가 있는 1.5mm 바이옵시 펀치	전자 현미경 과학	69031-02
	전자 현미경 과학	69031-03
4-12% 누페이지 겔	인비트로젠	NPO323BOX	단백질 그라디언트 젤
바이오분석기 시스템	애질런트	2100	RNA 분석 시스템
Dounce 티슈 그라인더	밀리포어 시그마	D8938	유리 조직 균질화기
파이버-라이트	돌란-제너 인더스트리 Inc.	모델 180	쿨 램프
유리판	랩렙코	11074010
로우 프로파일 블레이드	사쿠라 파인텍 USA Inc.	4689