초기 단계의 추간판 질환을 시뮬레이션하기 위한 장기 배양 모델 생성

초록

출처: Saravi, B. et al., 초기 단계의 추간판 질환을 시뮬레이션하기 위한 전염증성, 퇴행성 장기 배양 모델. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 TNF-α를 사용하여 초기 단계 추간판(IVD) 질환에 대한 전염증 및 퇴행성 장기 배양 모델의 개발을 보여줍니다. TNF-α를 추간판에 주입하는 절차를 설명하고 TNF-α가 IVD의 염증 및 저하를 유도하는 메커니즘을 설명합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.

1. 추간판(IVD) 배양 및 로딩

1. 추간판(IVD)을 IVD 챔버로 옮기고 IVD 배양 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, 생리학적 그룹의 경우 4.5g/L 고포도당 DMEM, 병리학적 그룹의 경우 2g/L 저포도당 DMEM) + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 2% 태아 송아지 혈청 + 1% ITS(5μg/mL 인슐린 포함, 6 μg/mL 트랜스페린 및 5 ng/mL 셀레니어산) + 50 μg/mL 아스코르브산염-2-인산염 + 1% 비필수 아미노산 + 일차 세포용 50 μg/mL 항균제)를 넣고 37 °C, 85% 습도 및 5% CO₂의 인큐베이터에 넣습니다.
2. 실험 그룹에 따라 생물 반응기 시스템 내에서 4일 동안 디스크를 배양합니다. 병리학적 그룹에서 2시간/일 동안 0.32-0.5MPa, 5Hz에서 퇴행성 로딩 조건을 유지합니다. 생리적 대조군에서는 0.02-0.2 MPa, 0.2 Hz의 로딩 프로토콜을 2 시간/일 동안 사용합니다.
   참고: 로딩 절차 중에 5mL의 IVD 배지가 들어 있는 챔버에 IVD를 배치합니다. 부피는 생물 반응기의 로딩 챔버 크기에 따라 다릅니다. 로딩 절차 사이에 자유 팽창 회복을 위해 7mL의 IVD 배양 배지가 있는 6웰 플레이트에 IVD를 놓습니다.
3. 실험 기간 동안 디스크 높이의 변화를 분석하기 위해 IVD 절제(기준선) 후 캘리퍼로 디스크 높이를 측정한 다음 자유 팽창 기간 후 및 실험 기간 동안 동적 하중 후 매일 측정합니다.

2. 추간판내 종양괴사인자-알파(TNF-α) 주사

1. 1일차의 첫 번째 동적 로딩 주기 직후, IVD를 페트리 접시에 수직 위치에 놓고 핀셋으로 IVD를 안정화합니다.
2. 재조합 TNF-α(IVD당 70μL의 인산염 완충 식염수(PBS) 중 100ng)을 30게이지 인슐린 바늘과 함께 병리학적 그룹의 핵 pulposus 조직에 주입합니다. 1분 내에 약 70μL의 속도로 천천히 주입합니다.
3. 주입 후 주사기를 IVD 내에서 반쯤 뒤로 당기고 주사기 플런저를 당겨 IVD에서 바늘과 주사기를 완전히 제거하기 전에 주입된 용액이 다시 누출되는 것을 방지하는 진공을 만듭니다.
   참고: 로딩 및 하룻밤 배양 후 주입된 용액의 분포를 평가하기 위해 트리판 블루 염료가 포함된 PBS를 주입하여 파일럿 실험을 수행합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아스코르브산염-2-인산염	시그마-알드리치, 세인트루이스, 미국	A8960
TNF-알파, 재조합 인간 단백질	R&D 시스템, 미국 미네소타	210-TA-005
소 IL-8 DIY ELISA	Kingfisher Biotech, 미국 세인트폴	DIY1028B-003
코닝 ITS 프리믹스	Corning Inc., 미국 뉴욕	354350
DMEM 고포도당	Gibco by life technologies, 미국 칼즈배드	10741574
DMEM 저포도당	Gibco by life technologies, 미국 칼즈배드	11564446
분자생물학용 에탄올	시그마-알드리치, 세인트루이스, 미국	09-0851
소 태아 혈청(FBS)	Gibco by life technologies, 미국 칼즈배드	A4766801
비필수 아미노산 용액	Gibco by life technologies, 미국 칼즈배드	11140050
페니실린/스트렙토마이신(P/S)	gibco by Life Technologies, 칼즈배드, 미국	11548876
인산염 완충액, 정제	시그마-알드리치, 세인트루이스, 미국	P4417
프리모신	InvivoGen, 미국 산디에고	개미-오후-05