Duction of Traumatic Brain Damage in a Rat Model Using a Lateral Fluid Percussion Device (측면 유체 타악기 장치를 사용한 쥐 모델에서 외상성 뇌 손상 유도)

초록

출처: McGuire, M. J., et al. 외상성 뇌 손상으로 인한 외상성 뇌 손상 후 간질 방전을 모니터링하기 위해 무선 비디오 EEG 시스템을 사용합니다. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오는 측면 유체 타악기 손상(FPI) 장치를 사용하여 쥐의 외상성 뇌 손상(TBI)을 유도하는 방법을 보여줍니다. 이 절차는 마취된 쥐의 두개골에 구멍을 뚫어 경막을 노출시키고 그 위에 캐뉼라를 부착하는 것을 포함합니다. 그런 다음 쥐를 장치에 연결하면 뇌에 도달하는 압력파를 생성하여 신경 세포 사멸과 혈관 손상을 일으킴으로써 TBI를 모방

합니다

프로토콜

1. 유체 타악기 부상

1. 실험복이나 수술복, 수술용 마스크, 수술용 장갑, 머리 덮개를 착용하고 수술 부위와 접촉하는 모든 도구와 재료를 소독합니다.
2. 10-12 주 된 수컷 Wistar 쥐 (350-400g)를 쥐에게 적합한 크기의 유도 챔버에서 3 % 이소 플루란과 1L / min 산소로 마취합니다. 유도 챔버에서 쥐를 제거하고 의식을 잃으면 준비 구역으로 옮깁니다. 멸균 안과 연고를 양쪽 눈에 바릅니다.
3. 눈 바로 위에서 귀의 꼬리 기저부까지 #40 칼날이 있는 전기 가위로 쥐의 머리에 있는 털을 면도하여 충분한 수술 영역을 만듭니다. 사이트에서 느슨하게 잘린 머리카락을 제거합니다.
4. 면도한 두피에 2% 클로로헥시딘 스크럽을 바르고 70% 에탄올을 바르면 수술 부위를 청소합니다. 중앙에서 시작하여 절개 부위에서 멀어지는 동심원을 그리며 바깥쪽으로 이동합니다. 이 과정을 3회 반복합니다. Betadine 용액을 같은 방식으로 부위에 바르고 건조시킵니다.
5. 마취된 쥐를 입위 안경테에 놓고 노즈콘을 통해 2-3% 이소플루란-1L/min 산소로 마취를 유지합니다. 철수 상실, 뒷다리 반사 상실 및 안구 반사 상실을 확인하여 쥐가 마취 수술 평면에 있는지 확인합니다.
6. 수술 내내 호흡수, 심박수, 체온 및 산소 포화도를 모니터링합니다. 심박수를 300-400bpm 사이로 유지하고 SpO₂를 90% 이상으로 유지합니다.
   메모: 뒷발에 부착된 맥박 산소 측정기를 사용하여 심박수와 SpO₂를 지속적으로 판독할 수 있습니다. 심박수가 400bpm 이상이면 쥐가 충분히 마취되지 않았음을 나타냅니다. 37°C로 설정된 직장 체온계와 연결된 자체 조절 보온 패드는 수술 내내 쥐 아래에 배치하여 체온을 유지할 수 있습니다. 광섬유 램프와 함께 광원이 있는 실체 현미경은 절차를 시각화하는 데 도움이 됩니다.
7. 절개 10-15분 전에 23g 바늘을 사용하여 절개 부위의 두피에 0.5% 부피바카인 염산염을 주사하여 국소 진통을 합니다.
8. #10 메스 날을 사용하여 두피의 피부와 근육을 통해 1.5-2.5cm의 정중선을 절개합니다. 피부와 근육을 수축시켜 두개골을 노출시키고 명확한 수술 영역을 제공합니다. 멸균 면봉으로 뼈에서 멀리 떨어진 근막과 지방 조직을 반사합니다.
   메모: 전기 소작 장치는 빠른 지혈을 달성하는 데 유용합니다.
9. 수술용 큐렛을 사용하여 왼쪽 두정골의 측면 융기를 깎아 매끄럽고 평평한 표면을 만들어 암컷-암컷 Luer lock hub의 기저부가 두개골과 같은 높이에 놓일 수 있도록 합니다.
10. 멸균 식염수에 2.0mg/mL 겐타마이신 용액을 두개골 표면과 주변 조직에 관개합니다. 멸균 면봉으로 여분의 용액을 닦아냅니다.
11. 뼈를 말리기 위해 두개골에 3% 과산화수소를 바르십시오.
    메모: 뼈가 충분히 건조되지 않으면 치과용 시멘트가 제대로 부착되지 않고 단단한 밀봉을 형성합니다.
12. 왼쪽 두정골을 통해 5mm 직경의 두개골 절제술 부위를 만듭니다.
    메모: 정위 프레임에 부착된 전동 드릴에 트레핀 비트를 삽입하면 두개골 절제술을 시작하는 데 도움이 될 수 있습니다. 직경 5mm의 트레핀이 있는 핸드 드릴을 사용하여 나머지 뼈를 통해 두개골 절제술을 천천히 마무리합니다. 두개골 절제술이 거의 완료되면, 트레핀을 역방향으로 돌려 기저에 있는 경막의 파열을 방지합니다. 디스크 둘레의 두개골이 얇아지고 두개골 플랩이 가볍게 눌렀을 때 헐거워지는 느낌이 듭니다.
13. 수술용 큐렛과 부드러운 조직 겸자로 뼈 덮개를 제거합니다.
    메모: 약간의 출혈이 발생할 수 있지만 멸균 면봉으로 부드러운 압력을 가하면 지혈을 빠르게 얻을 수 있습니다.
14. 실체 현미경과 조명을 사용하여 경막에 파열의 징후가 있는지 육안으로 검사하십시오. 두개골 절제술 부위 둘레에는 얇은 뼈 테두리가 남게 됩니다. 경막이 파열되지 않도록 주의하면서 부드러운 조직 집게로 이 테두리를 부드럽게 제거합니다.
15. 두개골을 70% 에탄올로 면봉으로 닦아 뼈 가루를 제거하고 두개골을 건조시킵니다.
16. Luer 잠금 허브의 하단 가장자리 주위에 cyanoacrylate 젤 접착제를 얇게 바르고 개구부를 막지 않고 두개골 절제술 위의 두개골에 고정합니다. 접착제가 경막에 닿지 않도록 주의하십시오. 또한 허브의 외부 바닥 주위에 얇은 접착제 층을 추가하여 Luer 잠금 장치를 제자리에 밀봉합니다.
17. 치과 용 시멘트 슬러리를 준비하십시오. Luer 잠금 허브의 바닥 주변과 위에 두개골 표면에 시멘트를 바르고 제자리에 고정합니다.
18. 주사기와 바늘을 사용하여 멸균 방부제가 없는 인공 뇌척수액(CSF) 용액(pH 7.4)으로 Luer Lock Hub를 채워 테두리 상단 위로 볼록한 식염수 덩어리가 보이도록 합니다.
    메모: 이 용액은 치과 시멘트가 건조될 때 경막을 촉촉하게 유지하고 밀봉의 무결성을 나타내는 역할을 합니다. 용액 수준이 조금이라도 떨어지면 이는 시스템의 누출을 나타내는 것이므로 Luer 잠금 장치를 제거하고 교체해야 합니다.
19. 치과 시멘트가 완전히 경화되면 가스 마취를 중단하고 입체 프레임에서 쥐를 제거합니다.
20. FPI 장치 옆의 플랫폼에 쥐를 놓습니다.
21. FPI 장치에는 유체 저장소 끝에 있는 압력 변환기에서 확장되는 곡선형 금속 팁이 있습니다. 12cm 길이의 압력 튜브를 곡선 팁 끝에 고정하고 반대쪽 끝은 2cm 수 Luer 잠금 트위스트 커넥터로 끝납니다. 쥐의 두개골에 있는 허브의 암 끝을 수 커넥터에 연결하여 쥐를 FPI 장치에 고정합니다.
    메모: 연결이 단단히 고정되어 있고 시스템에서 모든 기포가 제거되었는지 확인하십시오.
22. 동물을 흉골 누운 상태로 눕히고 금단 반사가 돌아오는지 반복적으로 확인합니다. 쥐가 금단 반사를 회복했지만 여전히 진정 상태가 되면 FPI 장치의 진자를 풀어 단일 20ms 압력 펄스를 일으키고 부상을 유발합니다.
    메모: 동물이 깊이 마취된 상태에서 부상을 유발하지 않는 것이 중요한데, 이는 신경인성 폐부종으로 인한 폐부종으로 인한 사망률 증가를 유발하는 경향이 있기 때문입니다. 모든 장치는 가변성을 나타냅니다. 그러나 이 실험에 사용된 장치에서 해머를 17° 각도로 배치하면 2.2 - 2.3 대기압 펄스가 생성됩니다. 다치지 않은 가짜 동물은 유도 부상에 대한 실제 유체 펄스를 제외하고 모든 동일한 절차를 거칩니다.
23. 부상 후 즉시 FPI 장치에서 쥐를 분리하고 흉골 누운 곳에 놓고 자발 호흡이 돌아올 때까지 콧방울을 통해 보충 산소(1L/분)를 제공합니다. 무호흡은 부상으로 인해 예상되는 결과입니다. 필요한 경우 쥐가 스스로 자발적으로 호흡하기 시작할 때까지 백 밸브 마스크를 통해 주기적으로 수동 호흡을 제공합니다.
    메모: 일반적으로 무호흡은 2분 미만 동안 지속됩니다. 카테콜아민 파열로 인한 압력 펄스 투여 직후 심박수(>500bpm)의 일시적인 급격한 상승이 관찰됩니다. 이것은 쥐의 발에 부착된 맥박 산소 측정기로 모니터링할 수 있으며 심각한 부상이 발생했음을 나타내는 가능한 지표 역할을 할 수 있습니다.
24. 쥐를 지속적으로 모니터링하고 바로잡기 반사(네 팔다리 모두에서 안정적인 보행)가 돌아오는 시간을 기록합니다.
25. 각 쥐에 대한 대기압 펄스의 크기는 서로 ± 0.05기압 이내여야 합니다. 각 압력 펄스가 오실로스코프에서 진폭과 지속 시간이 일관된 부드러운 신호를 생성하는지 확인합니다.
    메모: 잡음이 있는 신호는 부상 펄스를 전달하기 전에 제거해야 하는 시스템의 기포를 나타낼 수 있습니다. 이 실험에서 심각한 부상을 일으키는 대기압 펄스는 일반적으로 30-60분의 동물 바로잡기 시간을 초래하는 펄스입니다. 이 올바른 시간 범위는 약 40-50%의 사망률과 관련이 있습니다.
26. 지지 관리로 예열된 식염수 10mL를 피하로 투여합니다.
27. 쥐를 집 우리로 되돌리고 최소 4시간 동안 회복할 때까지 기다립니다.
    메모: 쥐를 즉시 마취 상태로 되돌릴 때 사망률이 증가하는 것이 관찰되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.00mm 드릴 비트	드릴 비트 City: 새로운 초경 공구	05M200
3M ESPE 듀렐론 카르복실레이트 시멘트	3M , 노이스 독일	38019	치과용 시멘트
4-0 봉합사	Ethicon, 뉴저지주 서머빌	K831H	4-0 Ethicon Perma-hand 실크, 26mm 1/2c 테이퍼포인트, 30"(75cm), 블랙 브레이드 비흡수성 봉합사
5mm 외경 트레핀	정밀 과학 도구	18004-50
뒤몽 #6 집게	정밀 과학 도구	11260-20
뒤몽 #7b 집게	정밀 과학 도구	11270-20
ecg자동	EMKA Technologies, 버지니아주 폴스처치
암 루어 스레드 스타일 커플러 클리어 폴리카본	콜-파머 악기	스코#45501-22	주문 로트 #214271
풋 파워 드릴	Grobet USA, 뉴저지주 칼스타트	모델 C-300
GentaMax 100 (겐타마이신, 황산염 용액)	Clipper Distributing Company LLC에서 제조한 Phoenix, St. 조셉, 미주리		NDC 57319-520-05
Hill's Prescription Diet A/d 반려견/고양이	Hill's Pet Nutrition, Inc. , 캔자스주 토피카
IOX2 소프트웨어	EMKA Technologies, 버지니아주 폴스처치
이소플로란, USP	Piramal Enterprise Limited, 인도 안드라		확인서 66794-013-25
IsoTech 마취기	서지벳	WWV9000
측면 FPI 장치	앰사이언	302	곡선 팁, 압력 튜브 확장. 나사 잠금 커넥터(Cole-Palmer; #4550-22)
라이카 A60 실체현미경	라이카 바이오시스템즈, 버지니아주 리치먼드	PN: 10 450 488
마르카인(0.5%) 부피바카인 hcl 주사 usp 5 mg/mL	호스피라, 레이크 포레스트, 일리노이	CA-3627	50mL 다회 용량 바이알; 국방위원회 0409-1610-50
마이크로 애드슨 집게	정밀 과학 도구	11018-12
봉합사 절단기가 있는 Olsen-Hegar 바늘 홀더	정밀 과학 도구	12002-14
겐타마이신이 함유된 PALACOS R+G 뼈 시멘트	헤레우스,	참고: 5036964	1 x 0.5g 겐타마이신을 함유한 방사선 불투과성 뼈 시멘트
포비돈-요오드 용액			베타딘
푸랄루베 수의사 연고	Dechra 수의학 제품, 오버랜드 파크 KS		NDC 17033-211-38
메스 칼날(#10) 및 홀더	Integra Miltex, 펜실베이니아 주 요크	참조: 4-110
메스 손잡이 - #4	정밀 과학 도구	10004-13
낫 나이프	Bausch + Lomb Storz 악기	N1705 흠	5mm 곡선 블레이드. 라운드 핸들. 전체 길이 168mm, 6.6 인치.
실버스타인 마이크로 미러	Bausch + Lomb Storz 악기	N1706 S8	3mm. 각도는 45도입니다. 전체 길이 180mm, 7.2인치
열 소작 장치	가이거 의료 기술, 델라스코 카운실 블러프스, IA	모델 번호: 150
베티벡스	Dechra 수의학 제품, 오버랜드 파크 KS		수의학 pHyLyteTM 주입 pH 7.4 (다중 전해질 주입, 유형 1, USP)
위스타 IGS 쥐	찰스 리버	스트레인 코드 003	부상 당시 12주
Wullstein 견인기	정밀 과학 도구	17018-11

를 통해 연결됨 직경 위치