동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토에 의해 검토되었습니다.
1. 조직 채취 전 준비
- 원심분리기를 4 oC.
로 설정합니다.
- 각 샘플에 대해 직경이 약 1.3, 0.8 및 0.4mm씩 감소하는 3개의 유리 파스퇴르 피펫 세트를 화염 연마합니다.
- 1ml의 차가운 버퍼 A가 들어 있는 라벨이 붙은 1.7ml 튜브를 준비하고 튜브를 얼음 위에 보관합니다.
- 해부를 수행할 뇌 절단 매트릭스, 주걱 및 유리판(또는 거꾸로 된 유리 페트리 접시)이 들어 있는 얼음 트레이를 준비합니다. 유리판에서 두 개 이상의 면도날을 미리 식히고 티슈 페이퍼를 사용하여 티슈에 닿는 모든 기구를 건조시킵니다.
- 조직을 채취하기 전에 효소 용액을 실온(RT)에서 30분 동안 해동합니다.
2. 조직 채취 및 해부
- 조직 채취 90분 전에 행동 또는 약물 치료를 시작하십시오.
참고: 여기에 표시된 결과를 위해, 새로운 환경(테스트 조건)에서 쥐와 집 우리(대조 조건)에 보관된 순진한 쥐에게 5mg/kg 메스암페타민의 급성 복강 내 주사를 수행했습니다.
- 쥐를 포화 이소플루란이 함유된 유리 건조제 병에 넣어 마취하고 30-60초 후에 단두대를 사용하여 쥐의 목을 베십시오.
가위를 사용하여 머리의 피부와 근육을 제거하고 두개골을 노출시킵니다. 롱거스를 사용하여 두개골을 자르고, 구멍의 매그넘을 열고, 두개골의 뒤쪽 부분을 제거합니다. 룽거스를 사용하여 두개골의 위쪽 가장자리를 잘라 뇌를 노출시킵니다. 뇌가 손상되지 않도록 주의한다. 작은 주걱을 사용하여 뇌를 부드럽게 퍼내고 들어 올립니다. 뇌가 자유로워질 때까지 뇌를 들어 올리고 신경을 절단하십시오.
- 면도날을 사용하여 조직을 해부합니다.
참고: 다음 방법 중 하나를 사용하여 조직 샘플을 얻습니다: (2.3.1) 갓 절부된 조직; (2.3.2) 해부 후 동결 조직; 또는 (2.3.3) 얼어붙은 뇌 전체에서 해부된 냉동 조직. 뇌 절단 매트릭스, 면도날 및 유리판은 응축수가 세포의 저긴장성 용해로 이어질 수 있으므로 해부 및 다진 과정 전반에 걸쳐 건조한 상태로 유지하십시오. 정확한 해부를 위해 돋보기를 사용하십시오.
- 갓 절부한 조직의 경우, 갓 추출한 뇌를 얼음 위에서 식힌 뇌 절단 매트릭스(1mm 간격으로 면도날용 구멍이 있는 쥐 뇌 모양의 금속 주형)에 넣습니다. 미리 식힌 면도날을 두 개 이상 슬롯에 삽입하여 관심 뇌 영역이 포함된 코로나 조각을 자릅니다. 자른 조각을 식힌 유리판에 놓습니다.
참고: 냉각된 유리판에서 관심 있는 뇌 영역을 해부합니다.
- 해부 후 동결된 조직의 경우, 위의 2.3.1에서 설명한 것과 유사하게 갓 추출한 뇌 조각에서 관심 있는 뇌 영역을 절개합니다. 절개된 조직을 마이크로튜브에 넣고 마이크로튜브를 -40ºC 이소펜탄에 20초 동안 담가 조직을 빠르게 동결합니다. 추가 처리가 있을 때까지 절개된 조직을 -80ºC 냉동고에 항상 냉동 보관하십시오.
- 냉동 조직의 경우, 갓 추출한 뇌를 즉시 -40ºC의 이소펜탄으로 얼리고 -80ºC의 밀봉된 백에 넣어 최대 6개월 동안 보관합니다.
- 해부 당일, 얼어붙은 뇌를 약 -20ºC(-18ºC 이하)로 설정된 저온 유지점에 약 2시간 동안 두어 온도를 평형을 이룹니다.
참고: 이 온도에서는 뇌를 쉽게 절단할 수 있지만, 훨씬 낮은 온도에서는 뇌를 너무 부서지기 쉬워서 안전하게 절단할 수 없습니다.
- 면도날을 사용하여 냉동 유지 장치에서 얼어붙은 뇌의 1 - 2mm 관상 절편을 자릅니다. 얼어붙은 조건에서는 무딘 12-16 게이지 바늘을 사용하여 이 조각에서 조직 펀치를 얻습니다. 추가 처리가 있을 때까지 절개된 조직을 항상 냉동 상태로 보관하십시오.
- 다지기 전에 절개된 조직을 덮기 위해 Buffer A 1 - 2 방울을 추가합니다. 두 개의 면도날을 사용하여 조직에서 대부분의 백질을 제거하여 나머지 분쇄 과정에서 뉴런이 손실되는 것을 방지합니다. 동결된 조직으로 시작하는 경우 Buffer A 용액을 적용하기 전에 차가운 유리판에서 조직을 1분 이상 해동시키지 마십시오.
- 식힌 유리판에 면도날로 각 직교 방향으로 조직을 100회 다집니다. 다질 때 면도날을 유리판에 수직으로 잡으십시오.
참고: 철저한 다지기는 모든 프로토콜 단계에서 중요합니다.
- 면도날을 사용하여 다진 조직을 1ml의 차가운 버퍼 A가 들어 있는 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 3 - 5회 뒤집어 다진 모든 조직을 용액에 유지합니다.
위치
3. 세포 해리
참고: 다음 모든 단계에 대해 부드러운 엔드 오버 엔드 믹싱을 사용하십시오. 와류 믹서를 사용하지 말고 세포 손상을 일으키는 기포를 피하십시오.
- 샘플 튜브를 110 x g에서 4ºC에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 폐기합니다. 차갑고 갓 해동한 효소 용액 1ml(단백질 분해 효소 혼합물 포함)를 마이크로튜브의 내벽에 천천히 추가합니다. 즉시 전체 펠릿을 빨아들이고 적당히 큰 팁 직경의 피펫으로 4번만 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 다진 조직 펠릿을 분산시킵니다.
- 펠릿이 바닥에 달라붙는 것을 방지하기 위해 즉시 마이크로튜브를 뒤집고 4 oC에서 30분 동안 종단 간 혼합으로 샘플을 배양합니다.
- 효소 조직 소화 후, 960 x g에서 튜브를 4ºC에서 2분 동안 원심분리합니다. 상등액을 제거하고 0.6ml의 차가운 버퍼 A를 추가합니다. 버퍼 A를 추가한 직후 동일한 피펫 팁을 사용하여 전체 펠릿을 빨아들여 펠릿을 분산시키고 위아래로 부드럽게 5회 피펫합니다.
- 소화된 조직을 기계적으로 분쇄하고 다음 단계를 사용하여 15ml 튜브에 수집합니다. 각 샘플에 대해 라텍스 전구에 부착된 내림차순 직경이 약 1.3, 0.8 및 0.4mm인 3개의 화염 광택 유리 파스퇴르 피펫 세트를 별도로 사용합니다.
- 1.3mm 유리 피펫으로 각 샘플을 10회 부드럽게 분쇄합니다. 샘플을 얼음 위에 2분 동안 가라앉힙니다(파편과 해리되지 않은 세포는 바닥에 가라앉습니다). 상등액(~ 0.6ml)을 모아 15ml 원추형 튜브(튜브 #1)로 옮깁니다.
- 남은 펠릿에 0.6ml Buffer A 용액을 추가합니다. 0.8mm 유리 피펫으로 샘플을 10회 분쇄합니다. 샘플을 얼음 위에서 2분 동안 가라앉힙니다. 상등액(~ 0.6ml)을 모아 동일한 15ml 원추형 튜브 #1로 옮깁니다.
- 남은 펠릿에 0.6ml Buffer A 용액을 추가합니다. 0.4mm 유리 피펫으로 샘플을 10회 분쇄합니다. 샘플을 얼음 위에서 2분 동안 가라앉힙니다. 상층액(~ 0.6ml, 해리되지 않은 세포가 있는 펠릿을 건드리지 않음)을 수집하고 동일한 15ml 원뿔형 튜브 #1로 옮깁니다.
참고: 다음 분쇄 단계를 위해 0.4mm 직경의 피펫을 튜브 #1에 보관하십시오.
- 가장 작은 유리 피펫(직경 ~ 0.4mm)을 사용하여 3.4.3단계를 3회 더 반복하고 상등액을 별도의 15ml 원추형 튜브(튜브 #2)에 모읍니다.
- 수집된 세포 현탁액을 튜브 #1 및 #2에 0.4mm 유리 피펫을 사용하여 10회 더 분쇄하고 얼음 위에 보관합니다.
4. 세포 고정 및 투과성
- 각 튜브에 800μl의 100% 저온 에탄올(사용 전 -20 oC에서 보관)을 추가하여 샘플당 4개의 마이크로튜브(튜브 #1의 세포용 마이크로튜브 2개, 튜브 #2의 세포용 마이크로튜브 2개)를 준비하고 얼음 위에 보관합니다. 참고: 최종 에탄올 농도는 50%입니다.
- 피펫 ~ 800 μl의 세포 현탁액(tube#1 및 tube#2에서)을 차가운 에탄올을 포함하는 4개의 튜브 각각에 넣고 튜브를 뒤집어 샘플을 혼합합니다.
- 얼음 위에서 15분 동안 튜브를 배양하고 5분마다 튜브를 뒤집습니다.
- 고정/투과 후 1,700 ºC에서 4분 동안 1,700 x g에서 튜브를 원심분리하고 상층액을 버립니다. 세포 손실을 방지하기 위해 50μl의 용액을 남겨 둡니다.
참고: 이 단계의 펠릿은 흰색이며 투과 전보다 튜브 벽에 덜 달라붙습니다. 따라서 펠릿이 없는 마이크로 튜브의 벽을 만져 상층액을 조심스럽게 제거하고 마이크로 피펫을 사용하여 천천히 상층액을 끌어올립니다.
5. 세포 여과
- 다음과 같이 콜드 PBS를 사용하여 4.4단계에서 펠릿을 다시 현탁합니다.
- 튜브 #1에서 나오는 두 개의 마이크로튜브 중 하나에 550μl의 차가운 PBS를 추가하고 적당히 큰 직경의 피펫 팁을 사용하여 세포 현탁액을 위아래로 5회 부드럽게 피펫팅합니다. 튜브 #2에서 나오는 하나의 마이크로튜브에 대해 동일한 작업을 반복합니다.
- 튜브 #1의 세포에 대해 동일한 피펫을 사용하여 첫 번째 세포 현탁액을 두 번째 펠릿으로 옮깁니다. 결합된 세포 현탁액을 위아래로 5회 부드럽게 피펫팅하여 두 번째 펠릿을 재현탁합니다.
- 튜브 #2의 세포에 대해 5.1.2에 설명된 대로 펠릿(즉, 세 번째 및 네 번째 마이크로튜브)을 재현탁하고 결합합니다.
