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1. RT 반응을 Micromixing
- micromixing과 RT 반응을 수행하기 전에, RT 반응의 원하는 온도로 micromixer를 평형.
- 37 내부 micromixer를 놓고 ° C (또는 RT 공급 업체에서 권장하는 온도) RT 반응의 시작하기 전에 적어도 1 시간 보육.
- 반대 transcriptase 공급자에 따라 RT 믹스를 설정 (Promega, Qiagen에서 Omniscript에서 예 MMTV - RT) 방법 대신 NG - μg의 총 RNA 입력 (예 : 0.1-1pg/μl)의 사용 단일 셀 금액 제외 금액은 공급 업체에 의해 권장합니다.
- 우리는 표준 살균, nuclease없는 200μL 얇은 벽의 PCR 튜브를 사용합니다.
- 그들은 혼합 준비 마자 안전 micromixer에 위치 RT 튜브. micromixer은 RT 반응의 기간 동안 37 ° C 배양기 안에서 유지됩니다.
- 적절한 빈도와 micromixing의 진폭을 선택합니다. 이 예제에서 우리는 150Hz 사용합니다.
- 에 micromixer 스위치 및 RT 반응 (60 분)의 전체 기간 동안 그것을 두십시오.
- micromixer 끄고 RT 반응이 완료되면 RT 튜브를 꺼내.
- 얼음 RT 튜브를 삽입 및 정량 중합 효소의 연쇄 반응 (qPCR 또는 실시간 PCR)과 같은 추가 애플 리케이션을 정상적으로 진행합니다.
2. 대표 결과 :
RT 반응의 맥락에서 micromixing의 장점은 다른 혼합 방법이 (예를 들어, 흔들림 vortexing 또는 분쇄) 사용하는 경우에 상대적으로 cDNA 수확량의 증가이다. 이것은 cDNA를 사용 정량 중합 효소의 연쇄 반응 (qPCR 또는 실시간 PCR)의 후속 분석에 따라, 예를 들어 볼 수 있습니다. 그림 2A 바로 전에 RT 보육 (흑백, "분쇄"로 RT 반응의 분쇄와 비교하여 처음 5 분 동안 micromixing의 효과 (파란색, "micromixed5") 또는 전체 60 분 (빨간색, "micromixed60")를 보여줍니다 ). 이 경우에는 앞의 RT 반응의 부피 25μL이고 그것은 총 RNA의 2.5pg이 포함되어 있습니다. cDNA 대표 Nurr - 1 mRNA를 검출하기위한 primers를 사용하여 qPCR의 흔적은 위에 표시된되며, 수단 ± 같은 실험을 3 반복으로 50 %의 최대 형광에 도달 사이클의 수를 전문가, 대리인은 아래 꾸몄다 있습니다. 별표는 통계적으로 중요한 차이 (Tukey 다중 비교와 편도 ANOVA)을 나타냅니다. 앞의 RT 반응의 전체 60 분 micromixing은 분쇄에 비해 상당한 개선을 생산하는 반면 위의 RT 반응의 첫 번째 5 분 micromixing은 분쇄 이상이 아닌 상당한 개선을 생산합니다, 규모있는 것은 약 15 qPCR에 해당되었다 주기, 평균.
micromixing의 혜택도 얻을 이후 qPCR 제품의 곡선 분석을 용해에서 볼 수 있습니다. 유일한 일관성 qPCR을 생산 처음 5 분 또는 분쇄를위한 micromixing 반면에 이전 RT 반응의 전체 60 분 micromixing 그림 2B에 설명된 실험, 중복 표본의 일관성 qPCR 신호 (그림 2Ba, 2 빨간 흔적) 결과 흔적 (그림 2Ba, 2 블루 흔적 2 검은 흔적, 각각). 회색 흔적은 qPCR 반응 밖으로 버려졌습니다 cDNA있는 부정적인 컨트롤 ( "neg.")입니다. 본 실험에서 qPCR 제품은 확실했다 그들의 온도 (즉, 용해 곡선 분석)을 올렸에 의해 변성되었을 때 그 적절한 PCR 제품 (즉, mRNA의보다 높은 농도는 반대로 qPCR에 의해 베꼈는데 및 증폭했을 때 얻은 동일했습니다 amplicon, 표시되지 데이터) 60 분 (그림 2Bb, 2 붉은 자취)에 대한 micromixed했다만이 다음과 같은 RT 반응을 제시했다. 모든 다른 (즉 micromixed5, 분쇄 및 부정적인 컨트롤)은 대체 amplicon 제품 (예 : 뇌관의 dimers) 생성.
그림 1. 표준 실험실 RT 반응에 micromixing를 적용하기위한 프로토콜의 흐름 다이어그램. 물리적인 원리 참여, micromixer 및 내부 micromixer 구축에 더 자세한 설명은 참고 문헌 13,14에서 제공하는
그림 2. 달리 표준 실험실 RT 반응에서 mRNA의 단일 셀 수량 구성된 RT 반응 앞에 적용 micromixing의 장점을 보여주는 대표 qPCR 데이터입니다. Nurr - 1 유전자를 인코딩 cDNA 나타내는 mRNA를 검출 qPCR 추적 예. 이전 RT 반응이 25μL의 볼륨 총 RNA의 2.5pg 포함되어 ° C 60 분 37 인큐베이터에서 수행되었다. RT 반응은 R의 분쇄에 의해 혼합되었다T는 이전 (빨간색 흔적, "micromixed60"RT 반응 (푸른 흔적 "micromixed5")의 처음 5 분 동안 micromixed 또는 RT 반응의 전체 60 분 micromixed 부화 (검은 흔적, "분쇄")에 혼합 ). 수단 ± 50 % 최대 형광에 도달하는 데 필요한 qPCR 사이클의 수를 전문가, 대리인은 N은 아래 꾸몄다있는이 실험 = 3 반복합니다. 별표 상당한 차이 (Tukey 다중 비교와 단방향 ANOVA)을 나타냅니다. B 다른 qPCR 실험이 25μL의 볼륨 총 RNA의 25pg를 포함하는 RT 반응에 따라 이번 Nurr - 1 cDNA 제품을 검토. qPCR의 흔적 (A)뿐만 아니라 얻은 qPCR 제품의 곡선 분석을 용해가 (B) 다른 혼합 조건 표시됩니다. 아무 cDNA가 이전 RT 반응에 포함되지 않은있는 부정적인 컨트롤도 (회색 흔적 "neg.") 포함되어 있습니다. mRNA의보다 높은 농도로 RT 반응도 수행 및 (b) micromixed60에 대한 (붉은 흔적) 샘플 사람들에게 동일한 용해 곡선 봉우리를 (데이터가 표시되지 않음) 생산되었다.