마우스 뇌 조직에서 세포막 단백질의 팔미토일화 상태 평가

초록

출처: Speca, D. J., et al. 뇌막 단백질의 팔미토일화의 정량적 측정을 위한 Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 마우스 뇌 조직에서 분리된 세포막 단백질의 팔미토일화 상태 분석을 보여줍니다. 이 과정에는 비팔미토일화 시스테인을 노출시키고 차단한 다음 팔미토일화 시스테인에 결합하는 폴리머를 사용하여 분리된 단백질의 팔미토일화 상태를 평가하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 마우스 뇌막의 준비

1. 단두대 장치를 사용하여 마우스의 목을 베고 뇌를 빠르게 해부합니다(해부 절차 중에 발생할 수 있는 팔미토일화 변화를 최소화하기 위해 가능한 경우 <1분 내에). 10mL의 균질화 완충액(표 1)을 얼음 위의 유리 균질기(~12스트로크)에서 즉시 균질화합니다.
2. 원심분리기는 4°C에서 1,400 x g에서 15분 동안 용해합니다. 상층액을 얼음 위의 새 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 동일한 부피의 균질화 완충액과 원심분리기에 710 x g에서 4 °C에서 10분 동안 재현탁합니다.
3. 1.2단계의 상등액을 40,000 x g에서 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다.
4. 상층액(cytosolic fraction)을 버리고 펠릿화된 멤브레인(P2) 분획을 균질화 buffer.
   에 재현탁합니다. 메모: 시료는 급속 냉동하여 나중에 사용할 수 있도록 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
5. 단백질 수치를 정량화하기 위해 비신초닌산(BCA) 분석을 수행합니다. APEGS(Acyl-PEGyl exchange gel-shift) 분석의 경우 1.5mL 튜브에서 470μL의 버퍼 A(표 1) 부피에서 ~100-200mg 단백질(최대 250mg)로 시작합니다. >13,000 x g에서 25°C에서 10분 동안 초음파 처리 및 원심분리하여 불용성 단백질을 제거합니다. 가용화된 단백질을 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다.

2. 아실-PEGyl 교환 겔 시프트(APEGS) 분석

1. 이황화 결합을 방해하고 유리 시스테인을 차단합니다.
   1. 25 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP; 25 μL, 원액에서 첨가됨)에서 배양하여 이황화 결합을 방해합니다. 표 1) 55°C에서 60분 동안.
   2. 50mM N-에틸말레이미드(NEM; 12.5μL, 원액에서 첨가됨; 표 1) 실온에서 3시간 동안
      메모: 반응은 하룻밤 사이에 연장될 수 있습니다.
2. 클로로포름 메탄올(CM) 침전을 수행합니다.
   1. 단백질 용액을 1.5mL 튜브에서 폴리프로필렌 또는 유리 튜브로 옮기고, 이 튜브는 적당한 속도로 스윙 버킷 로터에서 원심분리할 수 있습니다. 5mL 튜브가 이상적입니다. 4 가지 부피 (2 mL)의 메탄올 (MeOH)을 넣고 잠시 와류를 일으킨다.
   2. 두 부피(1mL)의 클로로포름과 와류를 짧게 추가합니다.
   3. 3 가지 부피 (1.5 mL)의 탈 이온수 (dH₂O)를 넣고 잠시 와류를
   일으킨다.
   4. 3,000 x g의 시료를 스윙 버킷 로터에서 25°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
   5. 상부 위상을 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오.
   6. MeOH 3 부피 (1.5 mL)를 넣고 불투명 한 단백질 팬케이크가 파편화되지 않도록주의하면서 부드럽지만 철저히 섞습니다.
   7. 3,000 x g의 원심분리기, 스윙 버킷 로터에서 25°C에서 10분 동안 원심분리기.
   8. 유리 혈청학적 피펫을 사용하여 단백질 팬케이크를 방해하지 않고 가능한 한 많은 상부를 제거합니다.
   9. 펠릿을 1mL의 MeOH로 조심스럽게 헹굽니다.
   10. 펠릿을 최소 10분 동안 자연 건조하십시오.
       메모: 건조된 펠릿은 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
3. 하이드록실아민(NH₂OH, HAM)을 사용하여 팔미토일-티오에스테르 결합의 절단을 수행합니다.
   1. 125 μL의 완충액 A에 단백질 침전물을 재현탁시키고 간단히 초음파 처리합니다. >13,000 x g에서 25°C에서 10분 동안 원심분리기를 사용하여 불용성 물질을 제거합니다. 가용화된 단백질을 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
   2. 375 μL의 버퍼 H(HAM+; 표 1) 또는 버퍼 T(HAM-; 표 1)을 선택하고 25°C에서 60분 동안 샘플을 배양합니다.
4. 2.2.
   단계에서 설명한 CM 침전을 반복합니다. 메모: 건조된 펠릿은 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
5. 보호되지 않은 시스테인에 mPEG를 추가합니다.
   1. 10mM TCEP를 함유하는 100μL의 완충액 A에 펠릿을 재현탁합니다. 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
      메모: CM 침전 단계에서 단백질의 상당한 손실이 발생하는 것은 정상입니다. 이후의 모든 단계는 1.5mL 튜브에서 수행되어 단백질 부피를 최대 ~120−130 μL로 제한합니다. 이것은 최종 CM 침전 동안 단백질 손실을 줄일 것입니다.
   2. 20mM mPEG-5k(25μL, 원액에서 첨가됨; 표 1) 단백질 시료를 추출하고 피펫팅으로 혼합한다. 25 °C에서 60분 동안 종단 간 회전으로 배양합니다.
   3. 통합되지 않은 mPEG-5k를 제거하려면 조정된 부피 4부피의 MeOH(500μL), 2부피의 클로로포름(250μL) 및 3부피의 dH_2O(375μL)를 사용하여 2.2단계에서 설명한 대로 CM 침전을 수행합니다. >13,000 x g에서 25°C에서 10분 동안 원심분리기.
   4. 두껍고 응집성 팬케이크를 피하고 이전과 같이 상부 단계를 조심스럽게 제거합니다. MeOH 1mL를 넣고 부드럽지만 완전히 섞습니다. >13,000 x g에서 25°C에서 10분 동안 원심분리기.
   5. 상등액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 MeOH 1mL로 헹굽니다. 25°C에서 10분 동안 >13,000 x g의 원심분리기.공기 건조 펠릿.
      >메모: 건조된 펠릿은 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
   6. 건조된 펠릿을 50μL의 버퍼 A(TCEP 또는 환원제 제외)에 재현탁합니다.

결과

표 1: APEGS 분석에 사용되는 솔루션. 균질화 완충액 및 완충액 A는 미리 준비할 수 있습니다. 그러나 프로테아제 억제제와 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)는 사용 직전에 첨가하십시오. 다른 모든 솔루션은 신선하게 준비해야 합니다.

완충기	구성 요소	작동 conc.	코멘트
균질	0.32 M 자당, 1 mM 트리스 pH 7.2, 1 mM MgCl2

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
하이드록실아민 (HAM)	써모피셔	26103
메톡시-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)	NOF	ME-050MA	MW ~5000 kDa
마이크로퓨지	에펜도르프	5415R	또는 이에 상응하는 장비
N-에틸말레미드(NEM)	칼비오켐	34115	독성이 강함
밀도 측정용 광학 이미저	Azure Biosystems	사파이어 생체 분자 이미저	또는 이에 상응하는 장비
캡이 있는 폴리프로필렌 튜브	피셔 사이언티픽	14-956-1D
혈청학적 피펫 (유리)	피셔 사이언티픽	13-678-27D
탁상용 원심분리기	베크먼	알레그라 X-15R	또는 이에 상응하는 장비
트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP)	EMD 밀리포어	580560