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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 마우스 뇌막의 준비
- 단두대 장치를 사용하여 마우스의 목을 베고 뇌를 빠르게 해부합니다(해부 절차 중에 발생할 수 있는 팔미토일화 변화를 최소화하기 위해 가능한 경우 <1분 내에). 10mL의 균질화 완충액(표 1)을 얼음 위의 유리 균질기(~12스트로크)에서 즉시 균질화합니다.
- 원심분리기는 4°C에서 1,400 x g에서 15분 동안 용해합니다. 상층액을 얼음 위의 새 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 동일한 부피의 균질화 완충액과 원심분리기에 710 x g에서 4 °C에서 10분 동안 재현탁합니다.
- 1.2단계의 상등액을 40,000 x g에서 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다.
- 상층액(cytosolic fraction)을 버리고 펠릿화된 멤브레인(P2) 분획을 균질화 buffer.
에 재현탁합니다.
메모: 시료는 급속 냉동하여 나중에 사용할 수 있도록 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
- 단백질 수치를 정량화하기 위해 비신초닌산(BCA) 분석을 수행합니다. APEGS(Acyl-PEGyl exchange gel-shift) 분석의 경우 1.5mL 튜브에서 470μL의 버퍼 A(표 1) 부피에서 ~100-200mg 단백질(최대 250mg)로 시작합니다. >13,000 x g에서 25°C에서 10분 동안 초음파 처리 및 원심분리하여 불용성 단백질을 제거합니다. 가용화된 단백질을 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
2. 아실-PEGyl 교환 겔 시프트(APEGS) 분석
- 이황화 결합을 방해하고 유리 시스테인을 차단합니다.
- 25 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP; 25 μL, 원액에서 첨가됨)에서 배양하여 이황화 결합을 방해합니다. 표 1) 55°C에서 60분 동안.
- 50mM N-에틸말레이미드(NEM; 12.5μL, 원액에서 첨가됨; 표 1) 실온에서 3시간 동안
메모: 반응은 하룻밤 사이에 연장될 수 있습니다.
- 클로로포름 메탄올(CM) 침전을 수행합니다.
- 단백질 용액을 1.5mL 튜브에서 폴리프로필렌 또는 유리 튜브로 옮기고, 이 튜브는 적당한 속도로 스윙 버킷 로터에서 원심분리할 수 있습니다. 5mL 튜브가 이상적입니다. 4 가지 부피 (2 mL)의 메탄올 (MeOH)을 넣고 잠시 와류를 일으킨다.
- 두 부피(1mL)의 클로로포름과 와류를 짧게 추가합니다.
- 3 가지 부피 (1.5 mL)의 탈 이온수 (dH2O)를 넣고 잠시 와류를
일으킨다.
- 3,000 x g의 시료를 스윙 버킷 로터에서 25°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
- 상부 위상을 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오.
- MeOH 3 부피 (1.5 mL)를 넣고 불투명 한 단백질 팬케이크가 파편화되지 않도록주의하면서 부드럽지만 철저히 섞습니다.
- 3,000 x g의 원심분리기, 스윙 버킷 로터에서 25°C에서 10분 동안 원심분리기.
- 유리 혈청학적 피펫을 사용하여 단백질 팬케이크를 방해하지 않고 가능한 한 많은 상부를 제거합니다.
- 펠릿을 1mL의 MeOH로 조심스럽게 헹굽니다.
- 펠릿을 최소 10분 동안 자연 건조하십시오.
메모: 건조된 펠릿은 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
- 하이드록실아민(NH2OH, HAM)을 사용하여 팔미토일-티오에스테르 결합의 절단을 수행합니다.
- 125 μL의 완충액 A에 단백질 침전물을 재현탁시키고 간단히 초음파 처리합니다. >13,000 x g에서 25°C에서 10분 동안 원심분리기를 사용하여 불용성 물질을 제거합니다. 가용화된 단백질을 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
- 375 μL의 버퍼 H(HAM+; 표 1) 또는 버퍼 T(HAM-; 표 1)을 선택하고 25°C에서 60분 동안 샘플을 배양합니다.
- 2.2.
단계에서 설명한 CM 침전을 반복합니다.
메모: 건조된 펠릿은 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
- 보호되지 않은 시스테인에 mPEG를 추가합니다.
- 10mM TCEP를 함유하는 100μL의 완충액 A에 펠릿을 재현탁합니다. 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
메모: CM 침전 단계에서 단백질의 상당한 손실이 발생하는 것은 정상입니다. 이후의 모든 단계는 1.5mL 튜브에서 수행되어 단백질 부피를 최대 ~120−130 μL로 제한합니다. 이것은 최종 CM 침전 동안 단백질 손실을 줄일 것입니다.
- 20mM mPEG-5k(25μL, 원액에서 첨가됨; 표 1) 단백질 시료를 추출하고 피펫팅으로 혼합한다. 25 °C에서 60분 동안 종단 간 회전으로 배양합니다.
- 통합되지 않은 mPEG-5k를 제거하려면 조정된 부피 4부피의 MeOH(500μL), 2부피의 클로로포름(250μL) 및 3부피의 dH2O(375μL)를 사용하여 2.2단계에서 설명한 대로 CM 침전을 수행합니다. >13,000 x g에서 25°C에서 10분 동안 원심분리기.
- 두껍고 응집성 팬케이크를 피하고 이전과 같이 상부 단계를 조심스럽게 제거합니다. MeOH 1mL를 넣고 부드럽지만 완전히 섞습니다. >13,000 x g에서 25°C에서 10분 동안 원심분리기.
- 상등액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 MeOH 1mL로 헹굽니다. 25°C에서 10분 동안 >13,000 x g의 원심분리기.공기 건조 펠릿.
>메모: 건조된 펠릿은 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
- 건조된 펠릿을 50μL의 버퍼 A(TCEP 또는 환원제 제외)에 재현탁합니다.