마우스 뇌 조직에서 세포막 단백질의 팔미토일화 상태 평가

초록

출처: Speca, D. J., et al. 뇌막 단백질의 팔미토일화의 정량적 측정을 위한 Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 마우스 뇌 조직에서 분리된 세포막 단백질의 팔미토일화 상태 분석을 보여줍니다. 이 과정에는 비팔미토일화 시스테인을 노출시키고 차단한 다음 팔미토일화 시스테인에 결합하는 폴리머를 사용하여 분리된 단백질의 팔미토일화 상태를 평가하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 마우스 뇌막의 준비

1. 단두대 장치를 사용하여 마우스의 목을 베고 뇌를 빠르게 해부합니다(해부 절차 중에 발생할 수 있는 팔미토일화 변화를 최소화하기 위해 가능한 경우 <1분 내에). 10mL의 균질화 완충액(표 1)을 얼음 위의 유리 균질기(~12스트로크)에서 즉시 균질화합니다.
2. 원심분리기는 4°C에서 1,400 x g에서 15분 동안 용해합니다. 상층액을 얼음 위의 새 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 동일한 부피의 균질화 완충액과 원심분리기에 710 x g에서 4 °C에서 10분 동안 재현탁합니다.
3. 1.2단계의 상등액을 40,000 x g에서 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다.
4. 상층액(cytosolic fraction)을 버리고 펠릿화된 멤브레인(P2) 분획을 균질화 buffer.
   에 재현탁합니다. 메모: 시료는 급속 냉동하여 나중에 사용할 수 있도록 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
5. 단백질 수치를 정량화하....

결과

표 1: APEGS 분석에 사용되는 솔루션. 균질화 완충액 및 완충액 A는 미리 준비할 수 있습니다. 그러나 프로테아제 억제제와 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)는 사용 직전에 첨가하십시오. 다른 모든 솔루션은 신선하게 준비해야 합니다.

완충기	구성 요소	작동 conc.	코멘트
균질	0.32 M 자당, 1 mM 트리스 pH 7.2, 1 mM MgCl2

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
하이드록실아민 (HAM)	써모피셔	26103
메톡시-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)	NOF	ME-050MA	MW ~5000 kDa
마이크로퓨지	에펜도르프	5415R	또는 이에 상응하는 장비
N-에틸말레미드(NEM)	칼비오켐	34115	독성이 강함
밀도 측정용 광학 이미저	Azure Biosystems	사파이어 생체 분자 이미저	또는 이에 상응하는 장비
캡이 있는 폴리프로필렌 튜브	피셔 사이언티픽	14-956-1D
혈청학적 피펫 (유리)	피셔 사이언티픽	13-678-27D
탁상용 원심분리기	베크먼	알레그라 X-15R	또는 이에 상응하는 장비
트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP)	EMD 밀리포어	580560