알츠하이머병 모델링을 위한 아밀로이드-베타 방출 고분자 마이크로비즈 제작

초록

출처: Almari, B., et al. Fabrication of Amyloid-β-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modeling Alzheimer's Disease(알츠하이머병 모델링에 사용하기 위한 아밀로이드 분비 알긴산 마이크로비즈 제작). J. Vis. 특급 (2019).

이 동영상은 신경독성 아밀로이드-베타 분비 세포를 캡슐화하는 고분자 마이크로비드를 제조하는 방법을 보여줍니다. 세포-폴리머 현탁액은 마이크로비드 제조 장치를 통해 처리되며, 칼슘 가교를 통해 폴리머 겔화가 이루어지며 세포 주위에 구형 마이크로비드를 형성합니다. 이 폴리머는 세포 증식을 가능하게 하는 동시에 통제된 장기 아밀로이드-베타 방출을 가능하게 하여 알츠하이머병에 축적되는 것을 시뮬레이션합니다.

프로토콜

1. 준비

사항

1. 100mL의 ~4%(w/v) 알긴산 원액을 준비합니다.
   1. 알긴산 나트륨 염 4.4g의 무게를 달고 건조 분말을 100mL의 HEPES 완충 식염수(HBS, 20mM 하이드록시에틸피페라진 에탄 설폰산[HEPES](0.477g)와 150mM NaCl(0.877g)을 탈이온수에 첨가하여 수분을 공급합니다.
   2. 분당 ~500회전(rpm)으로 자석 교반기를 사용하고 최대 50°C까지 가열하여 완전한 알긴산 수화를 가능하게 합니다.
      메모: 알긴산이 완전히 수분을 공급받으려면 한두 시간이 걸릴 수 있습니다. 시간을 절약하기 위해 알긴산염 용액은 캡슐화 프로토콜 하루 전에 구성하고 다음 날까지 4°C에서 보관할 수 있습니다. 알긴산을 냉장 보관한 경우 수조 또는 핫 플레이트를 사용하여 37°C로 부드럽게 가열하고 사용 직전에 자석 교반기로 교반합니다.
   3. 사용하기 전에 0.22μm 공극 폴리에테르설폰(PES) 필터를 사용하여 알긴산 용액을 멸균 여과합니다. 여과는 알긴산염의 쉬운 흐름을 허용하기 위해 37 °C에서 권장됩니다. 온도를 낮추면 점도가 증가합니다.
2. 0.5 m CaCl₂ 1,000 mL를 준비한다.
   1. 55.49g의 무수 CaCl₂의 무게를 측정하고 1,000mL의 HBS(1,000mL의 탈이온수 중 20mM HEPES 및 150mM NaCl)에 용해시킵니다.
   2. 0.22μm 공극 PES 필터를 사용하는 멸균 필터.
3. 용해 혼합물 100mL를 준비합니다.
   1. 인산염 완충 식염수에 100mM HEPES(23.83g) 및 500mM 시트르산삼나트륨이수화물(147.05g) 용액을 준비합니다.
   2. NaOH 또는 HCl을 사용하여 pH 7.4로 조정합니다.

2. 캡슐화 시스템 설정

1. 층류 후드를 청소하십시오.
   1. UV 노출을 사용하여 캡슐화기가 포함된 층류 후드를 살균한 다음 70% v/v 에탄올 용액을 분무합니다.
   2. 10mL의 70% v/v 에탄올 용액과 10mL의 멸균 탈이온수로 캡슐화 시스템을 세척합니다.
   3. 300μm 노즐을 부착하고 2.1.2단계를 반복합니다.
   4. 여과된 알긴산 용액이 들어 있는 병, 여과된 염화칼슘 용액이 들어 있는 병 및 70% v/v 에탄올 용액과 함께 사용할 도구, 장비 및 빈 배양 플레이트를 스프레이하고 층류 후드에 놓습니다. 사용하기 전에 자외선을 다시 30분 동안 켜서 철저히 소독하십시오.
   5. 생물학적 등급의 소독액으로 채워진 폐기물 비커를 준비하고 비커를 후드에 넣습니다.
   6. 비커에 100mL의 멸균 CaCl₂(수성) 용액을 채우고 자석 교반기를 추가합니다. 교반 속도를 100rpm으로 설정합니다. 노즐 끝에서 18cm 높이의 자기 플랫폼에 비커를 놓습니다. 이 비커는 알긴산 비드를 수집하고 겔화를 허용하는 데 사용됩니다.
2. 캡슐화를 위해 세포를 준비합니다.
   1. 인큐베이터에서 세포를 제거하고 0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액을 사용하여 거의 합류점에 가까운 플라스크에서 분리하고 37°C에서 5-10분 동안 배양합니다.
   2. 세포 밀도 추정을 위해 샘플을 분리한 다음 나머지 세포를 1,000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 얻습니다.
   3. 펠릿을 HBS(20mM HEPES 및 150mM NaCl)에 재현탁하여 최종 원하는 세포 농도를 두 배로 높입니다(예: 1.5 x 10⁶ cells/mL의 최종 농도의 경우 HBS에서 세포를 재현탁하여 3 x 10⁶ cells/mL의 농도를 달성).
   4. 50mL 원심분리 튜브에서 세포 현탁액을 ~4%(w/v) 알긴산 용액과 1:1 비율로 혼합하여 ~2%(w/v) 알긴산 용액에서 원하는 세포 농도(예: 1.5 x 10⁶ cells/mL)를 포함하는 최종 현탁액을 얻습니다.
3. 캡슐화 매개 변수를 설정합니다.
   1. 캡슐화 기계의 속도를 최대 압출 속도(8.9mL/분), 전압을 1.0kV, 주파수를 5,500Hz.
      로 설정합니다. 메모: 이러한 매개변수는 이전에 직경이 550μm인 마이크로비드를 얻기 위해 최적화되었습니다.

3. 제작

1. 마이크로비즈를 제작합니다.
   1. 20mL 주사기에 5mL의 cell-alginate 현탁액을 로드하고 주사기를 캡슐화기에 부착합니다.
   2. 흐름을 활성화하여 캡슐화기를 시작하면 피더를 통해 cell-alginate 현탁액을 밀어 넣을 수 있습니다. 물방울의 흐름이 노즐을 통해 압출됩니다.
   3. 초기의 불균일한 흐름을 피하기 위해 폐기물 비커에 처음 1mL를 수집합니다.
   4. 나머지 4mL를 계속 실행하여 방울이 CaCl₂ 겔화 수조로 떨어지도록 합니다. 각 밀리리터는 개별적으로(그러나 연속적으로) 실행할 수 있으며 필요한 경우 4개의 다른 겔화 수조에 수집할 수 있습니다.
      메모: 겔화 수조와 접촉하면 액적의 알긴산은 겔화 수조의 칼슘 이온과 즉시 가교결합되어 구형 마이크로비즈를 형성합니다.
   5. 1분 후, 마그네틱 플랫폼에서 겔화 비커를 제거하고 마이크로비즈를 교반 없이 4분 더 방치합니다(실온에서 마이크로비즈 전체에 걸쳐 완전한 겔화를 허용하는 데 필요한 시간).
2. 마이크로비즈를 회수합니다.
   1. 한 쌍의 멸균 핀셋을 사용하여 큰 알긴산 파편이나 인공물을 제거한 다음 멸균 플라스틱 피펫을 사용하여 74μm 메쉬 필터로 옮겨 겔화 수조에서 마이크로비드를 회수합니다.
   2. 적절한 배양 배지를 사용하여 마이크로비드를 원심분리 튜브로 옮기고 세포 배양 배지에서 5분 동안 평형을 이룹니다.
   3. 배양 및 추가 실험을 위해 플라스크, 플레이트 또는 페트리 접시로 옮깁니다.
      메모: 겔화 수조는 재사용해서는 안 됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22 um PES 필터	Merck, 영국	SLGP033RS
15mm Netwell 인서트 74 um 메쉬 필터	Constar, 미국	#의 3477
갈조류에서 추출한 알긴산 나트륨 염	시그마-알드리치, 영국	A0682
염화칼슘	시그마-알드리치, 영국	C1016
CellTiter96 AQueous One Solution 세포 증식 분석	Promega, 미국	G3580
캡슐화기	(주)이노텍	IE-50	통권번호 05.002.01-2005
헤페스	시그마-알드리치, 영국	H4024
인산염 완충 식염수	시그마-알드리치, 영국	D1408
소금	시그마-알드리치, 영국	433209
Trispdium citrate 이수화물	시그마-알드리치, 영국	W302600-케이
트립신-EDTA 용액	시그마-알드리치, 영국	T4049

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