Inducing White Matter stroke in a Murine Model Using a Nitric Oxide Inhibitor(산화질소 억제제를 사용한 쥐 모델에서 백질 뇌졸중 유도)

초록

출처: Nunez, S., et al. 축삭 변성 및 백질 신경생물학 연구를 위한 피질하 백질 뇌졸중의 다재다능한 쥐 모델. 특급 J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 백질 내의 표적 뇌 좌표에 산화질소 억제제를 주입하여 마취된 마우스에서 백질 뇌졸중을 유도하는 정확한 기술을 보여줍니다. 이는 혈관 수축과 혈액 공급 억제로 이어져 신경 손상과 뇌졸중을 유발합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토

에 의해 검토되었습니다.

참고: 대상 쥐 개체군을 식별하는 것으로 시작합니다. 이전 연구에서는 수컷 야생형 C57/Bl6 마우스만 사용되었습니다. 그러나, 다양한 형질전환 또는 녹아웃 마우스도 사용될 수 있다. 정위 좌표는 C57/Bl6 해부학을 기반으로 합니다. 각 사용자는 처음에 백질에 대한 스트로크의 현지화를 확인하는 것이 좋습니다.

1. 백질 스트로크 유도 - 내측 각도 접근법

1. 원위 직경이 15-25μm 사이인 0.5mm 모세관을 사용하여 풀드 글라스 피펫을 준비하는 것으로 시작합니다.
2. 멸균 0.9% 생리식염수에 27.4mg/ml(130μM)의 L-Nio(N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine hydrochloride)의 멸균 10μl 분취액을 준비합니다.
3. 진공 라인에 연결된 튜브에 유리 피펫을 부착하여 소량의 L-Nio(2-5 μl)를 뽑은 유리 피펫에 미리 채웁니다. 피펫을 벤치 상단에 평평하게 놓고 당겨진 끝을 L-Nio 용액에 삽입합니다.
   1. 피펫의 0.5mm 부분이 2mm 이상 채워질 때까지 진공을 적용합니다. 진공 청소기를 끄고 피펫을 빼냅니다. 1.12단계까지 따로 보관하십시오.
4. 마우스를 유도 챔버에 놓고 기화기(5L/min 산소 5L 및 질소 0.5L/min로 흡입)를 통해 흐르는 표준 32% 이소플루란을 사용하여 1분 동안 또는 깊이 마취될 때까지 마우스의 마취를 유도합니다. 마우스를 정위 현미경이 장착된 정위 장치로 옮깁니다. 기화기(5L/min 산소 및 0.5L/min 질소로 흡입된 2L/min)와 노즈 콘을 통해 흐르는 32% 이소플루란을 사용하여 유지 마취를 제공합니다. 발가락 꼬집음으로 마취 깊이를 확인합니다.
5. 주입 암을 36°로 조정합니다.
6. 인발형 유리 피펫 홀더를 저용량 압력 주입 시스템의 말단부에 부착하고 정위 설정의 주입 암에 부착합니다.
7. 마취된 동물의 수염에 바셀린을 바르고 양쪽 눈에 인공 눈물 연고를 바릅니다. 머리 위에 5-10cm의 구멍을 뚫고 동물의 머리에 멸균 드레이프를 씌워 멸균 수술 영역을 준비합니다. 두개골 위에 있는 털을 면도하여 무균 수술 표면을 준비합니다. 베타딘과 70% 알코올 면봉을 번갈아 가며 두피를 청소합니다.
8. 멸균된 가위로 두피 정중선을 1.5cm 절개하여 두개골 표면을 노출시킵니다. 멸균 면봉으로 두개골을 말리고 1-3X 배율의 정위 현미경을 사용하여 멸균 마이크로 포인트 도구를 사용하여 위에 있는 골막 조직을 제거합니다.
9. Fine Point 마커를 사용하여 Bregma를 참조점으로 표시합니다.
10. Bregma에서 후방으로 시작하여 정중선 바로 왼쪽 전방으로 확장되는 멸균 미세 팁 수술용 드릴 비트를 사용하여 2mm 타원형 개두술을 드릴링합니다. 대뇌 피질을 시각화할 수 있도록 뼈 조각과 그 위에 있는 연조직을 제거합니다.
11. 멸균 식염수를 간헐적으로 한 방울 떨어뜨려 수술 부위와 피질 표면을 촉촉하게 유지하십시오.
12. 당겨진 유리 피펫을 정위 장치의 인젝터 암에 부착합니다. 피펫의 말단 끝을 Bregma에 정렬하고 정위 좌표를 0으로 만듭니다.
13. 피펫을 표 1에 제공된 첫 번째 전방/후방(A/P) 및 내측/외측(M/L) 좌표로 전진시킵니다.
14. 피펫을 피질 표면으로 전진시키고 등쪽/복부(D/V) 측정값을 영점 조정하십시오.
15. 표 1의 첫 번째 D/V 좌표에 도달할 때까지 피펫을 천천히 뇌에 통과시킵니다.
16. 20msec 펄스에 대해 20psi로 설정된 저용량 압력 주입 시스템을 사용하여 100nl의 L-Nio를 뇌에 주입하고 피펫 트랙의 역류를 방지하기 위해 5분 동안 기다립니다.
    1. 정위 현미경의 접안렌즈에 보정된 십자선을 사용하고 3배 배율을 사용합니다.
    2. 따라서 각 좌표 세트에 대해 인발된 유리 피펫에서 총 0.100mm³(0.5mm 직경 피펫의 0.5mm 길이, 100nl에 해당)을 변위합니다. 레티큘을 사용하면 사용된 배율과 스케일에 따라 각 설정이 달라지므로 측정하고 표준화할 수 있습니다.
    3. 각 주입 중 정확한 부피 측정을 위해 측면에서 현미경을 사용하여 각진 피펫에 접근하여 공기-유체 메니스커스가 시상면을 볼 수 있도록 합니다. 반월판은 피펫의 내벽과 외벽 모두의 동일한 초점면에 나타나야 합니다.
17. 피펫을 천천히 빼내고 표 1에 제공된 두 번째 및 세 번째 좌표 세트에서 1.13-1.16.3 단계를 반복합니다.
18. 최종 주입 후 피펫을 제거하고 개두술 부위를 채울 만큼 충분한 뼈 왁스를 놓습니다. 두피 상처의 가장자리를 대략적으로 만들고 피부 접착제로 묶습니다. 위치
19. 멸균 30G 바늘을 사용하여 0.5% 마르카인 0.1ml를 상처 가장자리에 주사하여 두피 절개 부위와 관련된 국소 통증을 예방합니다.
20. 동물을 사육장으로 돌려보내고 수술 후 항생제(0.48mg/ml 트리메토프림-설파메톡사졸 또는 0.5mg/ml 레보플록사신)를 식수에 5일 동안 공급합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
L-N5-(1-이미노에틸)오르니틴, 디하이드로클로라이드	칼비오켐	400600-20MG
이소플루란	피닉스 제약, Inc.	NDC 57319-559-06
모세혈관	세계 정밀 기기	50-821-807
피코스프리처	파커 인스트루먼테이션	피코스프리처 II
입체 설정	켄트 사이언티픽	KSC51725
피펫 풀러	코프	모델 720
실체현미경 SZ51	올림푸스	88-124
가는 가위	정밀한 과학 도구	14084-08
겸자	하버드 기구	2쪽: 72-8547
곡선 집게	하버드 기구	2쪽: 72-8598
둔기 해부 도구	정밀한 과학 도구	10066-15
드릴	드레멜	8220-1/28
드릴 비트	정밀한 과학 도구	19007-05
베트본드	3M	1469SB
마르케인	호스피라	국토통신번호 0409-1610-50
트리메토프림-설파메탁솔	STI 약국	확인해줘: 54879-007-16