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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토
에 의해 검토되었습니다.
참고: 대상 쥐 개체군을 식별하는 것으로 시작합니다. 이전 연구에서는 수컷 야생형 C57/Bl6 마우스만 사용되었습니다. 그러나, 다양한 형질전환 또는 녹아웃 마우스도 사용될 수 있다. 정위 좌표는 C57/Bl6 해부학을 기반으로 합니다. 각 사용자는 처음에 백질에 대한 스트로크의 현지화를 확인하는 것이 좋습니다.
1. 백질 스트로크 유도 - 내측 각도 접근법
- 원위 직경이 15-25μm 사이인 0.5mm 모세관을 사용하여 풀드 글라스 피펫을 준비하는 것으로 시작합니다.
- 멸균 0.9% 생리식염수에 27.4mg/ml(130μM)의 L-Nio(N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine hydrochloride)의 멸균 10μl 분취액을 준비합니다.
- 진공 라인에 연결된 튜브에 유리 피펫을 부착하여 소량의 L-Nio(2-5 μl)를 뽑은 유리 피펫에 미리 채웁니다. 피펫을 벤치 상단에 평평하게 놓고 당겨진 끝을 L-Nio 용액에 삽입합니다.
- 피펫의 0.5mm 부분이 2mm 이상 채워질 때까지 진공을 적용합니다. 진공 청소기를 끄고 피펫을 빼냅니다. 1.12단계까지 따로 보관하십시오.
- 마우스를 유도 챔버에 놓고 기화기(5L/min 산소 5L 및 질소 0.5L/min로 흡입)를 통해 흐르는 표준 32% 이소플루란을 사용하여 1분 동안 또는 깊이 마취될 때까지 마우스의 마취를 유도합니다. 마우스를 정위 현미경이 장착된 정위 장치로 옮깁니다. 기화기(5L/min 산소 및 0.5L/min 질소로 흡입된 2L/min)와 노즈 콘을 통해 흐르는 32% 이소플루란을 사용하여 유지 마취를 제공합니다. 발가락 꼬집음으로 마취 깊이를 확인합니다.
- 주입 암을 36°로 조정합니다.
- 인발형 유리 피펫 홀더를 저용량 압력 주입 시스템의 말단부에 부착하고 정위 설정의 주입 암에 부착합니다.
- 마취된 동물의 수염에 바셀린을 바르고 양쪽 눈에 인공 눈물 연고를 바릅니다. 머리 위에 5-10cm의 구멍을 뚫고 동물의 머리에 멸균 드레이프를 씌워 멸균 수술 영역을 준비합니다. 두개골 위에 있는 털을 면도하여 무균 수술 표면을 준비합니다. 베타딘과 70% 알코올 면봉을 번갈아 가며 두피를 청소합니다.
- 멸균된 가위로 두피 정중선을 1.5cm 절개하여 두개골 표면을 노출시킵니다. 멸균 면봉으로 두개골을 말리고 1-3X 배율의 정위 현미경을 사용하여 멸균 마이크로 포인트 도구를 사용하여 위에 있는 골막 조직을 제거합니다.
- Fine Point 마커를 사용하여 Bregma를 참조점으로 표시합니다.
- Bregma에서 후방으로 시작하여 정중선 바로 왼쪽 전방으로 확장되는 멸균 미세 팁 수술용 드릴 비트를 사용하여 2mm 타원형 개두술을 드릴링합니다. 대뇌 피질을 시각화할 수 있도록 뼈 조각과 그 위에 있는 연조직을 제거합니다.
- 멸균 식염수를 간헐적으로 한 방울 떨어뜨려 수술 부위와 피질 표면을 촉촉하게 유지하십시오.
- 당겨진 유리 피펫을 정위 장치의 인젝터 암에 부착합니다. 피펫의 말단 끝을 Bregma에 정렬하고 정위 좌표를 0으로 만듭니다.
- 피펫을 표 1에 제공된 첫 번째 전방/후방(A/P) 및 내측/외측(M/L) 좌표로 전진시킵니다.
- 피펫을 피질 표면으로 전진시키고 등쪽/복부(D/V) 측정값을 영점 조정하십시오.
- 표 1의 첫 번째 D/V 좌표에 도달할 때까지 피펫을 천천히 뇌에 통과시킵니다.
- 20msec 펄스에 대해 20psi로 설정된 저용량 압력 주입 시스템을 사용하여 100nl의 L-Nio를 뇌에 주입하고 피펫 트랙의 역류를 방지하기 위해 5분 동안 기다립니다.
- 정위 현미경의 접안렌즈에 보정된 십자선을 사용하고 3배 배율을 사용합니다.
- 따라서 각 좌표 세트에 대해 인발된 유리 피펫에서 총 0.100mm3(0.5mm 직경 피펫의 0.5mm 길이, 100nl에 해당)을 변위합니다. 레티큘을 사용하면 사용된 배율과 스케일에 따라 각 설정이 달라지므로 측정하고 표준화할 수 있습니다.
- 각 주입 중 정확한 부피 측정을 위해 측면에서 현미경을 사용하여 각진 피펫에 접근하여 공기-유체 메니스커스가 시상면을 볼 수 있도록 합니다. 반월판은 피펫의 내벽과 외벽 모두의 동일한 초점면에 나타나야 합니다.
- 피펫을 천천히 빼내고 표 1에 제공된 두 번째 및 세 번째 좌표 세트에서 1.13-1.16.3 단계를 반복합니다.
- 최종 주입 후 피펫을 제거하고 개두술 부위를 채울 만큼 충분한 뼈 왁스를 놓습니다. 두피 상처의 가장자리를 대략적으로 만들고 피부 접착제로 묶습니다. 위치
- 멸균 30G 바늘을 사용하여 0.5% 마르카인 0.1ml를 상처 가장자리에 주사하여 두피 절개 부위와 관련된 국소 통증을 예방합니다.
- 동물을 사육장으로 돌려보내고 수술 후 항생제(0.48mg/ml 트리메토프림-설파메톡사졸 또는 0.5mg/ml 레보플록사신)를 식수에 5일 동안 공급합니다.
