Detection of Protein-Protein Interactions in Drosophila larvae using a Proximity Ligation Assay(근접 결찰 분석을 사용한 초파리 유충의 단백질-단백질 상호작용 검출)

초록

출처: Wang, S., et al. 근접 결찰 분석을 사용하여 초파리 유충 신경근 접합부에서 현장 단백질-단백질 복합체 검출. J. Vis. 특급 (2015).

이 동영상은 근접 결찰 분석법(PLA)을 사용하여 초파리 신경근 접합부(NMJ)에서 단백질-단백질 상호 작용의 시각화를 보여줍니다. 체벽을 분리한 후 상호 작용하는 단백질을 1차 항체 및 PLA 접합 2차 항체로 조사합니다. 상호 작용하는 단백질의 근접성은 커넥터 올리고뉴클레오티드와 프로브의 결찰을 용이하게 하여 원형 DNA를 형성한 다음 롤링 서클 증폭에 의해 증폭됩니다. 형광 프로브는 증폭된 DNA에 결합하여 NMJ에서 단백질-단백질 상호 작용을 시각화할 수 있습니다.

프로토콜

1. 체벽 준비

참고: 세 번째 instar 유충 체벽의 준비(체벽 근육에 신경을 분포시키는 NMJ 연구를 위해)는 앞서 설명한 대로 수행되었지만 일부 수정이 가해졌습니다.

1. 해부
   1. 표준 절차를 사용하여 25 ° C에서 5-6 일 동안 플라이 스톡과 십자가를 들어 올립니다.
   2. 가는 집게를 사용하여 바이알이나 병에서 기어다니는 세 번째 instar 유충을 선택합니다.
   3. 인산염 완충 식염수(PBS)가 들어 있는 작은 페트리 접시에 유충을 씻어 음식물 입자를 제거합니다.
   4. 유충 한 마리를 실가드 디스크에 놓고 얼음처럼 차가운 PBS 몇 방울에 담그십시오. 얼음처럼 차가운 PBS를 사용하면 유충을 기절시켜 더 쉽게 조작할 수 있습니다. 해부 전반에 걸쳐 제제가 건조되지 않도록 항상 PBS에 잠겨 있는지 확인하십시오.
   5. 해부 현미경으로 두 개의 기관관이 보이도록 등쪽이 위를 향하도록 유충을 배치합니다(그림 1A). 집게를 사용하여 미세한 핀을 잡고 유충을 첨탑 근처의 뒤쪽 끝에 고정합니다(그림 1B). 다른 핀으로 입 고리 근처의 앞쪽 끝에 있는 큐티클을 뚫습니다. 유충을 세로로 부드럽게 늘린 다음 고정합니다(그림 1B).
   6. 현미해부 가위를 사용하여 핀 근처의 뒤쪽 끝을 꼬집어 작은 구멍을 만듭니다. 절개 부위는 큐티클을 통과할 수 있을 만큼 충분히 피상적이어야 합니다.
   7. 가위의 아래쪽 날 끝을 절개 부위에 놓고 두 기관 기관 사이의 등쪽 정중선의 전체 길이를 따라 자릅니다(그림 1C). 절단할 때 복부 체벽 근육이 손상되지 않도록 가위날을 약간 위쪽으로 향하게 하십시오.
   8. 후방에 배치된 핀보다 약간 앞쪽에 작은 수평 절개를 만듭니다(그림 1C). 앞쪽에 배치된 핀의 약간 뒤쪽에 또 다른 유사한 절개를 만듭니다(그림 1C). 절개 부위는 큐티클을 통과해야 합니다.
      참고: 1.1.7단계와 1.1.8단계의 절개 3개를 합쳐 ""와 같아야 하며, , 즉 유충 몸체의 등쪽에 왼쪽과 오른쪽 절개가 생성되어야 합니다.
   9. 집게로 내부 장기를 조심스럽게 청소하십시오. PBS를 몇 방울 강하게 떨어뜨리면 유충 몸에서 장기를 옮기는 데 도움이 되므로 더 쉽게 제거할 수 있습니다. 유충의 몸을 찌르면 체벽 근육에 손상을 줄 수 있으므로 피하십시오.
   10. 유충 몸체를 펼치고 모서리를 고정합니다(그림 1D). 고정할 때 체벽을 수평 및 수직으로 늘려 균일한 장력의 직사각형을 형성하고(모양은 그림 1G 참조) 이 과정에서 체벽 근육이 찢어지지 않도록 주의하십시오.
   11. 남아 있는 내부 장기를 모두 제거합니다(그림 1E).
2. 정착 및 투과
   1. 고정된 체벽을 Bouin's Solution 몇 방울에 담그십시오. 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 또는 4% 파라포름알데히드(PFA)를 대체 고정제로 사용합니다. 30분 동안 배양합니다.
   2. 인산염 완충액 식염수 트리톤(PBT)으로 3번 헹굽니다.
   3. 가는 집게를 사용하여 핀을 조심스럽게 제거하고 모서리를 통해 본체 벽을 실리콘화된 0.65ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 위치
   4. PLA가 준비될 때까지 4°C의 PBT에 체벽을 보관하십시오. 최적의 결과를 얻으려면 박리 후 하루나 이틀 이내에 체벽의 면역 염색을 시작하십시오.
      참고: 시약을 절약하고 분석 중에 모든 체벽이 동일하게 처리되도록 하기 위해 다른 유전자형을 단일 튜브에 배치할 수 있습니다. 유전자형은 체벽의 모서리를 다르게 절단하여 구별할 수 있습니다(예: 그림 1F 참조).

2. 면역조직화학

참고: 세 번째 instar 유충 체벽의 면역 염색은 앞서 설명한 대로 수행되었지만 일부 수정이 있었습니다.
참고: 달리 명시되지 않는 한 실온에서 부드럽게 교반하여 모든 단계를 수행하십시오.

1. 블로킹
   1. PBT로 체벽을 각각 10분씩 3회 세척합니다.
   2. 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 1시간 동안 차단
2. 면역염색
   1. 관심 단백질(1% BSA로 희석)을 두 개의 관심 단백질(1% BSA로 희석)에 대항하여 마우스 및 토끼 1차 항체로 체벽을 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이 경우 1:10 마우스 anti-Dlg(Dlg = 디스크 대형) 및 1:250 토끼 anti-HtsM(HtsM: Hu-li tai shao mutant)을 사용합니다. 생쥐나 토끼에서 만들어지지 않은 마커에 대한 항체도 포함될 수 있습니다 — 예: , 1:200 염소 항-Hrp (Hrp = 양고추냉이 과산화효소)를 사용하여 신경세포막을 묘사합니다.
   2. PBT로 각각 10분씩 3회 세탁합니다.
   3. 형광단 접합 2차 항체를 사용하여 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 마커(1% BSA로 희석)를 검출합니다. PLA 신호가 나중에 적색 형광단으로 시각화될 때, 마커를 검출하기 위해 다른 형광단을 사용해야 합니다 — 예: , 1:200 Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-goat를 사용하여 염소 anti-Hrp 항체를 검출합니다. 빛에 민감한 시약을 사용하기 때문에 이 시점부터 튜브를 어두운 곳에 보관하십시오.
      참고: 사용되는 키트는 마우스와 토끼에서 생성된 1차 항체 간에 PLA를 수행할 수 있도록 하며, 신호는 컨포칼 현미경 검사에서 빨간색 채널에 시각화됩니다. 원하는 경우, 다른 종에서 발생한 1차 항체와 다른 채널에서 시각화된 신호로 분석을 수행할 수 있는 다른 키트를 사용할 수 있습니다.

3. 근접 결찰 분석

참고: 달리 명시되지 않는 한 모든 단계를 실온에서 부드럽게 저어 수행하십시오.

1. PLA 프로브
   1. PBT로 체벽을 각각 10분씩 3회 세척합니다.
   2. PLA 프로브(1% BSA에 각각 1:5 희석)로 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 이 경우 40μl의 PLA 프로브 anti-mouse MINUS, 40μl의 PLA 프로브 anti-rabbit PLUS 및 120μl의 1% BSA를 사용하여 5-10개의 체벽의 적절한 침수 및 혼합을 보장합니다. PLA 프로브를 최대 1:25 희석해도 여전히 적절한 신호 대 잡음비(이 실험의 경우 , 즉 )를 얻을 수 있습니다.
2. 결찰
   1. Wash Buffer A로 체벽을 각각 5분씩 두 번씩 세척합니다.
   2. Ligation 용액(Ligation buffer에서 Ligase 1:40 희석)으로 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 이 경우 5 μl의 리가아제, 40 μl의 5 결찰 완충액 및 155 μl의 고순도 물을 사용하여 5-10 체벽의 적절한 침지 및 혼합을 보장합니다.
3. 증폭
   1. Wash Buffer A로 체벽을 각각 2분씩 두 번씩 세척합니다.
   2. 증폭 용액(증폭 완충액에서 중합효소 1:80 희석)으로 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 이 경우 2.5 μl의 중합효소, 40 μl의 5 증폭 완충액 및 157.5 μl의 고순도 물을 사용하여 5-10 체벽의 적절한 침지 및 혼합을 보장합니다.
4. 이미징 준비
   1. Wash Buffer B로 체벽을 각각 10분씩 두 번 세척합니다.
   2. 0.01x 워시 버퍼 B로 1분 동안 한 번 세척합니다.
   3. 장착하기 전에 최소 30분 동안 장착 용액 몇 방울로 평형을 이루거나 4°C에서 밤새 보관하십시오.
   4. 가는 집게를 사용하여 큐티클이 아래를 향하도록 하여 체벽을 플랫폼 슬라이드로 조심스럽게 옮깁니다. 몸체 벽을 행으로 배치하고 마운트턴트 한두 방울 이내에 동일한 방향으로 배치합니다. 기포가 발생하지 않도록 주의하면서 준비물 위에 22mm x 40mm 커버슬립을 놓고 투명한 매니큐어로 슬라이드를 밀봉합니다.
   5. 컨포칼 이미징이 준비될 때까지 -20°C의 어두운 곳에 슬라이드를 보관하십시오.

결과

그림 1: 세 번째 instar 유충 체벽의 준비. (아프) 체벽 해부를 나타내는 개략도. (A) 두 개의 기관관이 보이도록 등쪽이 위를 향하도록 한 개의 유충을 실가드 디스크에 놓습니다. (B) 유충을 앞쪽과 뒤쪽 끝에 미세한 핀으로 고정합니다. 이 과정에서 유충을 세로로 뻗습니다. (C) 미세 해부 가위로 유충 몸의 등쪽을 세 번 절개합니다. 절개 부위는 완료되면 "I"자 모양이 되어야 합니다. (D) 애벌레 몸을 펼치고 모서리를 고정하여 그 과정에서 몸벽을 수평 및 수직으로 늘려 균일하게 장력을 받는 직사각형을 형성합니다. (E) 남아 있는 내부 장기를 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
겸자(fine #5)	알메딕	대답10-704
실가드 디스크	세계적인 정밀 기기	SYLG184	엘라스토머 베이스와 경화제를 10:1 비율로 혼합합니다. 30분으로 설정합니다. 금형에 붓습니다(예: 12웰 세포 배양 플레이트 사용). 적어도 24 시간 동안 치료하십시오. 해부 할 때 60x15mm 페트리 접시 뚜껑의 뚜껑에 부착하십시오.
Minutien 핀(팁 직경 0.0125mm)	정밀 과학 도구	26002-10
미세해부 가위(초극세)	정밀 과학 도구	15200-00
플랫폼 슬라이드			투명한 매니큐어로 현미경 슬라이드에 22x22mm 커버슬립 2개를 붙이고 샘플 장착을 위해 사이에 <20mm의 간격을 남겨둡니다.
파1118	블루밍턴 초파리 주식 센터	3605
HTS01103	블루밍턴 초파리 주식 센터	10989	GFP 신호의 부재에 기초하여 동형접합 돌연변이를 선택할 수 있도록 스톡을 GFP 밸런서를 통해 재조정했습니다.
1x PBS (인산염 완충 식염수) : 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0			NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Bouin의 솔루션	시그마-알드리치	HT10132
4% PFA(파라포름알데히드): 1x PBS의 4% PFA			PFA(아나케미아 사이언스 - 66194-300). 솔루션을 만드는 방법에 대한 지침은 doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006을 참조하십시오.
PBT 1개(트리톤이 함유된 인산염 완충 식염수): 0.01% 트리톤이 함유된 PBS 1개			트리톤 X-100 (시그마-알드리치 - T8787)
1% BSA(소 혈청 알부민): 1x PBT 중 1% BSA			BSA (Bioshop Canada - ALB001). 4 °C에서 보관하십시오.
마우스 Anti-Dlg (디스크 대형)	발달 연구 Hybridoma Bank	4층3	1% BSA에 1:10 희석하여 사용하십시오.
토끼 안티 HtsM (Hu-li tai shao)			제공: Dr. Lynn Cooley (Yale University). 1% BSA에서 1:250 희석으로 사용하십시오.
토끼 항박(p21-활성 키나아제)			제공: Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). 1% BSA에 1:500 희석하여 사용하십시오.
마우스 anti-Wg (Wingless)	발달 연구 Hybridoma Bank	4D4	1% BSA에 1:5 희석하여 사용하십시오.
염소 anti-Hrp (양 고추 냉이 peroxidase)	잭슨 이뮤노리서치	Tel.: 123-065-021	1% BSA에서 1:200 희석으로 사용하십시오.
FITC-conjugated 당나귀 안티 염소	잭슨 이뮤노리서치	Tel.: 705-095-003	1% BSA에서 1:200 희석으로 사용하십시오.
Duolink In Situ PLA 프로브 안티 마우스 MINUS	시그마-알드리치	DUO92004
Duolink In Situ PLA 프로브 안티 래빗 PLUS	시그마-알드리치	DUO92002
Duolink 현장 검출 시약 레드	시그마-알드리치	DUO92008
1x 세척 버퍼 A : 0.01M 트리스, 0.15M NaCl, 0.05 % 트윈 20, pH 7.4	시그마-알드리치	DUO82049	Tris(Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl(Caledon - 7560-1), Tween 20(Fisher Scientific - BP337)
1x 세척 버퍼 B : 0.2M 트리스, 0.1M NaCl, pH 7.5	시그마-알드리치	DUO82049	트리스(Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl(Caledon - 7560-1)
0.01x 세척 버퍼 B: 2mM 트리스, 1mM NaCl, pH 7.5	시그마-알드리치	DUO82049	트리스(Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl(Caledon - 7560-1)
Duolink In Situ 마운팅 미디어(DAPI 포함	시그마-알드리치	DUO82040